王勇 譚巍 任澎

基礎(chǔ)研究

抑制JAK/STAT信號通路對心力衰竭大鼠心功能的影響

王勇 譚巍 任澎

作者單位：830000 新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科

目的 探討抑制JAK/STAT信號通路對心力衰竭大鼠血流動力學(xué)及BNP的影響。方法 實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組：對照組（n=15）；心力衰竭組（n=15），縮窄腹主動脈直徑至0.45 mm；AG490藥物干預(yù)組（n=15），腹主動脈縮窄術(shù)后每周經(jīng)腹腔注射AG490。術(shù)后觀察大鼠生存情況，分別在4周和8周后應(yīng)用超聲心動圖檢測IVSd、LVPWd、LVEDd、LVEDs和LVEF，并于第8周測量BNP的變化。結(jié)果 4周時(shí)心衰組大鼠 IVSd、LVPWd、LVEDs、LVEDd、LVEF 與對照組和 AG490干預(yù)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IVSd、LVEDd、LVEF與干預(yù)組和對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。8周時(shí)三組大鼠各項(xiàng)超聲檢測指標(biāo)均有明顯差異（P＜0.05），心衰組變化更明顯（P＜0.05）。心衰組大鼠血清BNP明顯高于其余兩組（P＜0.01）。AG490干預(yù)組BNP高于對照組、低于心衰組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 JAK/STAT信號通路參與慢性心力衰竭進(jìn)程，干預(yù)JAK/STAT信號通路可減輕腹主動脈縮窄大鼠心力衰竭的嚴(yán)重程度。

JAK/STAT信號通路； 心力衰竭； 腦鈉肽

心力衰竭（heart failure，HF）是心臟結(jié)構(gòu)及功能受損導(dǎo)致急性或漸進(jìn)性心功能障礙的一類臨床綜合征，是多種心臟、大血管病癥進(jìn)展到終末期的共同臨床表現(xiàn)。一旦發(fā)生心力衰竭，在多種病理生理改變影響下，致使心功能呈進(jìn)行性惡化，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量及遠(yuǎn)期預(yù)后，是目前全球重大公共健康問題之一[1]。心力衰竭發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，除了神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的改變外，還有多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與，其中酪氨酸蛋白激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子信號通路（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）通過炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激，細(xì)胞損傷，細(xì)胞增殖、分化等多種病理生理反應(yīng)影響心衰的進(jìn)程[2]。本研究通過使用JAK/STAT信號通路的阻斷劑干預(yù)該通路，觀察對心衰大鼠血流動力學(xué)及腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性Wistar大鼠45只（由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號：SCXK 新 2011-0004），體重（200±20）g，按隨機(jī)數(shù)字表法分成3組：對照組（n=15）、心力衰竭組（n=15）和 AG490干預(yù)組（n=15）。

1.1.2 儀器及試劑 超聲診斷儀（惠普M2424A）；12 MHz高頻探頭（飛利浦21380A）；電子天平；AG490；水合氯醛；青霉素（80萬單位/只）；4%多聚甲醛。

1.2 建立模型方法 所有實(shí)驗(yàn)大鼠手術(shù)之前均禁食至少12 h，電子天平測量體重后用10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，腹部手術(shù)區(qū)備皮、消毒。沿腹白線逐層切開皮膚及肌肉組織至劍突，充分暴露腹腔，在左腎動脈上方鈍性分離腹主動脈。對照組大鼠動脈只分離，不做結(jié)扎；心力衰竭組和AG490干預(yù)組將4.5號注射針頭（直徑0.45 mm）與腹主動脈平行放置，用6號PROLENE手術(shù)線將兩者共同扎緊，可見左腎缺血變白，然后拔出針頭，將內(nèi)臟歸位。三組大鼠均用3號慕斯線縫合手術(shù)切口。所有大鼠術(shù)后均給予鹽酸哌替啶（杜冷丁）肌肉注射鎮(zhèn)痛1次；青霉素80萬U/只，連續(xù)3 d肌肉注射，預(yù)防感染。

1.3 藥物干預(yù) 用二甲基亞砜（DMSO）溶解AG490，使最終濃度為1 mg/ml。AG490干預(yù)組大鼠從術(shù)后1周開始腹腔注射AG490，劑量為1 mg/kg，每周注射1次，共注射8周。

1.4 造模成功標(biāo)準(zhǔn) 對照組大鼠一般情況良好，每周體重增長正常；造模組大鼠表現(xiàn)出毛色發(fā)黃、脫毛、易怒、肺水腫、身體蜷縮、體重增長緩慢、活動能力下降、對外界刺激反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)，超聲心動圖檢查提示射血分?jǐn)?shù)＜50%。

1.5 超聲心動圖檢測 大鼠造模后4周、8周各檢測1次超聲心電圖，電子天平測量體重，用前文提到的方法麻醉，胸部備皮，使用12 MHz高頻探頭行超聲心動圖檢測。測量指標(biāo)：室間隔厚度（IVSd）、左室后壁厚度（LVPWd）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVEDs）和射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。以上檢測值均在檢測3個(gè)心動周期后計(jì)算均值。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法定量測定血清BNP濃度 超聲心動圖檢測后取大鼠動脈血，靜置30 min，以3500 r/min離心15 min，取上層血清置于EP管，按腦鈉肽ELISA試劑盒（Cloud Clone Corp，美國）說明書步驟完成加樣后，把酶標(biāo)板置于450 nm波長的酶標(biāo)儀上，測量各孔的OD值。根據(jù)BNP標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)濃度取Log10后的值（Y）與其相對應(yīng)的OD（X）做出標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)公式，再乘以稀釋倍數(shù)算出各樣品的BNP值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，所有計(jì)量資料先行正態(tài)性檢驗(yàn)，若滿足正態(tài)分布，多組間比較采取單因素方差分析，兩組間對比選擇LSD-t檢驗(yàn)，各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性行Pearson相關(guān)性分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對照組大鼠全部存活，一般情況良好，毛色正常，體重增長均勻，精神、活動、對外界反應(yīng)良好，飲食、飲水、排泄正常。

心衰組大鼠毛色發(fā)黃，出現(xiàn)背、腹部脫毛，精神欠佳，易激怒，呼吸道分泌物增多，身體蜷縮，體重過輕，活動能力下降，對外界刺激反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)。術(shù)后共存活10只，存活率為67%，依據(jù)術(shù)后一般情況以及超聲心動圖檢測結(jié)果心衰成模率為60%。

AG490藥物干預(yù)組大鼠精神、活動、體型、毛色等心衰體征相比心衰組大鼠均有所改善，共存活12只，存活率為80%。

2.2 血流動力學(xué)檢測 經(jīng)單因素方差分析，手術(shù)后4周時(shí)對照組、心衰組和AG490干預(yù)組的各項(xiàng)血流動力學(xué)指標(biāo)均有差異（P＜0.05）。進(jìn)一步行LSD-t兩兩比較：與對照組相比，AG490干預(yù)組大鼠LVPWd、LVEDs有所增厚（P＜0.05），而 IVSd、LVEDd、EF 在AG490組和對照組間無明顯差異；心衰組各項(xiàng)指標(biāo)與對照組相比均有明顯差異（P＜0.01）；心衰組與AG490 干 預(yù) 組 之 間 LVPWd、LVEDs、IVSd、LVEDd變化顯著（P＜0.01），EF差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 8 周 時(shí) 三 組 大 鼠 IVSd、LVPWd、LVEDs、LVEDd、LVEF變化更加顯著（P＜0.05），進(jìn)一步行LSD-t兩兩比較：心衰組 IVSd、LVPWd、LVEDs、LVEDd較對照組明顯增加，EF顯著降低（P＜0.01），AG490干預(yù)組各項(xiàng)指標(biāo)高于對照組而略低于心衰組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1、2。

表1 術(shù)后4周各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)比較（±s）

表1 術(shù)后4周各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)比較（±s）

注：IVSd：室間隔厚度；LVPWd：左室后壁厚度；LVEDs：左室收縮末期內(nèi)徑；LVEDd：左室舒張末期內(nèi)徑；LVEF：左室射血分?jǐn)?shù)。與對照組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與心衰組比較，cP＜0.01，dP＜0.05

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表2 術(shù)后8周各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)比較（±s）

表2 術(shù)后8周各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)比較（±s）

注：IVSd：室間隔厚度；LVPWd：左室后壁厚度；LVEDs：左室收縮末期內(nèi)徑；LVEDd：左室舒張末期內(nèi)徑；LVEF：左室射血分?jǐn)?shù)。與對照組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與心衰組比較，cP＜0.01

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表3 各組大鼠血清BNP檢測結(jié)果比較（±s）

表3 各組大鼠血清BNP檢測結(jié)果比較（±s）

注：BNP：腦鈉肽。與對照組比較，aP＜0.01；與心衰組比較，bP＜0.01

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2.3 大鼠血清BNP檢測結(jié)果 對照組、心衰組、干預(yù)組：BNP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；行 LSD-t兩組間比較：與對照組比較，其余兩組均有明顯升高，而心衰組大鼠BNP升高程度明顯大于AG490干預(yù)組（P＜0.01）。見表 3。

2.4 BNP與各變量的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，BNP 與 IVSd、LVPWd、LVEDs、LVEDd、EF 均具有相關(guān)性（P＜0.01）。見表 4。

表4 各檢測指標(biāo)與BNP的相關(guān)性

3 討論

本研究采用部分結(jié)扎腹主動脈的方法建立心衰大鼠模型。該方法屬于壓力超負(fù)荷型的一種[3]，其主要機(jī)理為腹主動脈部分狹窄后，血流阻力增大，引起心臟后負(fù)荷相應(yīng)升高，心肌細(xì)胞水腫肥大，心肌代償性肥厚，但此時(shí)心室內(nèi)徑不變或稍減小，心臟出現(xiàn)向心性肥厚，此時(shí)的代償性增厚可以幫助心臟保持一定的心排出量。但若長期持續(xù)后負(fù)荷過重，肥大心肌細(xì)胞變長，心室壁變薄，心肌纖維斷裂，心室順應(yīng)性下降，心室擴(kuò)張，形成離心性肥厚，心臟增大，最終出現(xiàn)心功能不可逆性損害，發(fā)展為心衰[4]。另一方面后負(fù)荷升高導(dǎo)致心肌耗氧量增多，心交感神經(jīng)興奮性增加，由于腹主動脈狹窄，腎血流灌注不足，同時(shí)激活RAAS系統(tǒng)，形成水鈉潴留，引起AngⅡ增加，心臟內(nèi)環(huán)境改變引發(fā)血管收縮，進(jìn)一步加重心臟負(fù)荷，發(fā)生心肌重構(gòu)，左心室逐漸擴(kuò)大和泵血能力降低，導(dǎo)致心功能不全[5]。

心肌細(xì)胞的病理性改變和神經(jīng)內(nèi)分泌激活所致的系統(tǒng)反應(yīng)是導(dǎo)致心肌重構(gòu)進(jìn)展為心衰的兩個(gè)關(guān)鍵過程[6]。本研究采取的造模方法，利用腎臟血流灌注減少而激活RAAS系統(tǒng)。而AngⅡ-JAK/STAT轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活可刺激心肌肥厚向心衰轉(zhuǎn)變。當(dāng)心肌重構(gòu)、心功能不全發(fā)生鈉水潴留時(shí)，AngⅡ可與其1型受體結(jié)合，使JAKs激酶活化，促進(jìn)底物STAT的磷酸化。通過AngⅡ1型受體使心肌蛋白合成速度增加，發(fā)生心室肥厚甚至心肌纖維化，影響患者的心臟功能。有證據(jù)顯示，長時(shí)間的AngⅡ-JAK/STAT轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活可刺激心肌細(xì)胞肥大向心力衰竭轉(zhuǎn)變；STAT3及STAT5持續(xù)活化可使腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性增強(qiáng)從而加重缺血性心肌損傷[7]。

本實(shí)驗(yàn)中使用的AG490是JAK/STAT轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑，能選擇性抑制JAK2和JAK3，阻遏JAKs發(fā)生磷酸化，并能抑制部分STAT，干擾其與DNA結(jié)合，從而有效阻斷信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，是常用的JAK/STAT轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的阻滯劑。在本實(shí)驗(yàn)中，從術(shù)后1周開始，AG490干預(yù)組定期從腹腔注射AG490，超聲心動圖顯示在第4周時(shí)，心衰組大鼠出現(xiàn)了明顯向心性肥厚的表現(xiàn)，與對照組相比，IVSd、LVPWd明顯增厚（P＜0.01）。此時(shí)舒張期左室腔內(nèi)徑縮小，射血分?jǐn)?shù)有所降低，雖然與對照組差異明顯，但射血分?jǐn)?shù)仍在正常范圍內(nèi)，說明此時(shí)心功能尚可，還處于代償階段，與心衰早期的病理生理改變相符。AG490組大鼠在第4周時(shí)IVSd和LVEDd與對照組相比無顯著變化（P＞0.05），LVPWd、LVEDs稍有增加，射血分?jǐn)?shù)的變化不明顯（P＞0.05）。分析可能原因：此時(shí)干預(yù)組大鼠心肌已經(jīng)開始向心肌肥厚發(fā)生轉(zhuǎn)變，由于對信號通路的抑制作用可能緩解了心功能的急劇損害，故尚未出現(xiàn)典型的心肌重構(gòu)。8周時(shí)，心衰組大鼠IVSd、LVPWd、LVEDs變化進(jìn)一步顯著（P＜0.01），LVPWd增加明顯（P＜0.01），射血分?jǐn)?shù)降至45%以下，提示此時(shí)心臟已經(jīng)出現(xiàn)晚期的收縮功能障礙，心腔直徑增大，進(jìn)入心衰失代償階段。AG490干預(yù)組大鼠此時(shí)處于心肌肥厚狀態(tài)，心功能發(fā)生障礙，雖然也出現(xiàn)射血分?jǐn)?shù)下降，但與心衰組相比，心衰進(jìn)程明顯緩慢（P＜0.01）。這提示我們AG490抑制JAK/STAT轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對緩解心衰可能有一定的積極意義。

腦鈉肽（BNP）主要是由心室合成與分泌由32個(gè)氨基酸組成的一種具有生物活性的多肽，用于調(diào)節(jié)心臟功能。在正常狀態(tài)下，BNP在心室儲備量極低并且穩(wěn)定，通常以前體BNP（pro-BNP）形式在心室分泌的顆粒中儲存。當(dāng)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、心肌缺血，血流動力學(xué)發(fā)生變化時(shí)，左室收縮功能的降低和心室壁張力的增加可刺激pro-BNP迅速被釋放，進(jìn)入血液循環(huán)后降解形成有生物活性的BNP[8]。RAAS系統(tǒng)的激活是心力衰竭的重要機(jī)制之一，而BNP可以抑制腎素、醛固酮分泌，提升腎小球?yàn)V過率，對抗交感神經(jīng)、內(nèi)皮素及抗利尿激素活性，發(fā)揮血管擴(kuò)張、降低外周阻力、排尿、排鈉的作用，參與調(diào)節(jié)血壓、血容量及鹽平衡[9]；此外還具有增加心輸出量、對抗心肌肥厚、緩解心肌纖維化、擴(kuò)張心外膜及冠狀動脈的效應(yīng)。BNP目前已被廣泛認(rèn)為在心力衰竭中尤其是判斷左心功能障礙的心力衰竭中有著較高的敏感度、特異度及陰性預(yù)測意義。并且血清中BNP升高的水平與心衰嚴(yán)重程度呈正比，可用于判定心力衰竭程度及其預(yù)后[10]。本研究結(jié)果顯示，腹主動脈縮窄組的兩組大鼠較對照組大鼠都出現(xiàn)了BNP的明顯升高，且心衰組大鼠BNP升高水平高于AG490干預(yù)組，說明心衰組大鼠心衰程度較AG490干預(yù)組更為嚴(yán)重。

JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在心衰進(jìn)程及調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用，因此，對該轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的進(jìn)一步探索可能為研究心臟功能異常提供了一個(gè)新的視角。本研究僅觀察了血流動力學(xué)及BNP的改變，今后還需要對JAK/STAT信號通路在心力衰竭中的作用做更細(xì)致、長效的研究。

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The influence of cardiac function by inhibiting JAK/STAT signaling pathway in heart failure rat

WANG Yong，TAN Wei，REN Peng.Department of Cardiology，Xinjiang Autonomous Region People′s Hospital，Urumqi 830000，China

ObjectiveTo investigate the influence of hemodynamics and BNP by inhibiting JAK/STAT signaling pathway with AG490 in heart failure rat.MethodsWistar rats were randomly divided into three groups：control group（n=15）；heart failure group（n=15），narrowed abdominal aorta diameter up to 0.45 mm；AG490 intervention group（n=15），administered with AG490 by intraperitoneal injection after abdominal aortic coarctation.Observed the survival condition after the operation，at 4 weeks and 8 weeks detected the interventricular septal depth（IVSd），left ventricular posterior wall depth（LVPWd），left ventricular end diastolic diameter（LVEDd），left ventricular end systolic diameter（LVEDs），left ventricular ejection fraction（LVEF） by echocardiography，and BNP were investigated after 8 weeks.ResultsAt 4 weeks，the IVSd，LVPWd，LVEDs，LVEDd and LVEF in the heart failure group were significantly different from those in the control group and the AG490 intervention group（P＜0.05）.There was no statistically difference in IVSd，LVEDd and LVEF between the AG490 intervention group and the control group （P＞0.05）.At 8 weeks，there were significant differences in IVSd，LVPWd，LVEDs，LVEDd and LVEF between the 3 groups，the change of heart failure group was more obvious（P＜0.05）.The BNP in heart failure group was significantly higher than that in the other two groups（P＜0.01），the BNP in AG490 intervention group was higher than that in the control group，and lower than that in the heart failure group，the difference was statistically significant （P＜0.05）.ConclusionJAK/STAT signaling pathway involved in process of chronic heart failure，intervention of JAK/STAT signaling pathway can reduce the severity of heart failure of rats with abdominal aortic constriction.

JAK/STAT signaling pathway； Heart failure； BNP

REN Peng，E-mail：renpengcvd@126.com

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號：2015211C195）

任澎，E-mail：renpengcvd@126.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.10.022

Q95-33；R541.6

A

1672-5301（2017）10-0955-04

2017-05-04）