苗雨潤(rùn) 宋慶凱 匡德宣 陳玲霞 尹博文 李曉飛 代解杰

基礎(chǔ)研究

新生樹鼩心肌細(xì)胞與心肌成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)、純化及鑒定

苗雨潤(rùn) 宋慶凱 匡德宣 陳玲霞 尹博文 李曉飛 代解杰

作者單位：650118 云南省昆明市，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，樹鼩種子資源中心

目的 研究應(yīng)用樹鼩建立人類心血管病理、毒理細(xì)胞模型的純度較高、活力較強(qiáng)的心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞的方法。方法 使用差速貼壁1.5 h純化心肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),并比較5-溴-2-脫氧尿苷、阿糖胞苷及TGF-β抑制劑的純化效率以獲取最適純化方案，培養(yǎng)過程在37℃、5%CO2條件下進(jìn)行。使用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力以確定方法可行性。利用α-橫紋肌肌鈣蛋白（α-SA）及心肌肌鈣蛋白I（TnI）對(duì)樹鼩心肌細(xì)胞進(jìn)行免疫組化及免疫熒光鑒定，利用波性蛋白（Vimentin）對(duì)樹鼩心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色以達(dá)到鑒定目的。結(jié)果 原代培養(yǎng)新生樹鼩心肌細(xì)胞生長(zhǎng)良好。在倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)10 d左右的心肌細(xì)胞可以基本完成局部融合并伴有細(xì)胞搏動(dòng)。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞活力可以在最少15 d內(nèi)保持良好水平。細(xì)胞鑒定結(jié)果顯示，樹鼩心肌細(xì)胞α-SA免疫組化呈陽(yáng)性，Tn I免疫熒光鑒定呈陽(yáng)性，心肌成纖維細(xì)胞呈陰性，符合一般心肌細(xì)胞特征；心肌成纖維Vimentin免疫熒光結(jié)果呈陽(yáng)性。結(jié)論 分離純化得到的樹鼩心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞純度較高、結(jié)構(gòu)完整并具有相對(duì)較高的細(xì)胞活力，是一種較為理想的、可以應(yīng)用于樹鼩建立人類心血管病理、毒理細(xì)胞模型的心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞。

樹鼩； 原代培養(yǎng)； 心肌細(xì)胞； 心肌成纖維細(xì)胞； 鑒定

心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，是進(jìn)行心血管疾病研究的一項(xiàng)基礎(chǔ)工作，體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞保存了結(jié)構(gòu)及功能上的某些特點(diǎn)，同時(shí)去除了體內(nèi)各種神經(jīng)、體液因素對(duì)心肌細(xì)胞的影響。目前，心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于心血管疾病機(jī)理、闡明藥物或毒物的心肌毒性作用機(jī)制，以及心臟組織工程學(xué)等研究[1]。自 Harary等[2]在 1960年首次成功對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，后又經(jīng)Baudino等[3]不斷的改進(jìn)，心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)有了長(zhǎng)足的進(jìn)展。但是由于細(xì)胞體外培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)等方面都存在一些不足，關(guān)于心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者仍然在不斷地進(jìn)行探索和改進(jìn)。常被用于心肌毒理、藥理研究模型的動(dòng)物是大鼠和小鼠。但這兩者和人類的差異較大，往往不能更好地、更真實(shí)地反映一些藥物的作用機(jī)制，這成為心血管毒理、藥理研究的桎梏。近年來，樹鼩作為一種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廣泛應(yīng)用于各種疾病、藥理模型。由于相對(duì)于大鼠、小鼠而言，樹鼩在進(jìn)化程度上更接近人類，加之與非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物相比，樹鼩來源廣泛、價(jià)格低廉，可以推測(cè)樹鼩在構(gòu)建心血管疾病方面具有更好的前景。但截至目前依舊沒有關(guān)于體外樹鼩心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的報(bào)道。本研究對(duì)報(bào)道的大鼠、小鼠心肌細(xì)胞原代體外培養(yǎng)方法加以改進(jìn)，培養(yǎng)出純度較高、活力較強(qiáng)的新生樹鼩心肌原代細(xì)胞,以填補(bǔ)樹鼩在心血管疾病研究方面的空白，滿足科學(xué)實(shí)驗(yàn)的需求。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心提供的新生樹鼩12只，雌雄不限，成年樹鼩體重110~130 g，幼年樹鼩體重不等。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（滇）K2013-0001，使用許可證：SYXK（滇）K2013-0001。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM/Highglucose細(xì)胞培養(yǎng)液（GE），胎牛血清（FBS，BI），0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 混合消化液（BI），膠原酶（Solarbio），中性蛋白酶（Solarbio），二硫蘇糖醇（DTT），抗壞血酸鈉（Solarbio），ITS（Insulin-Transferrin-Selenium Solution，Gibco），5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU，Sigma），阿糖胞苷（索萊寶），選擇性ALK5抑制劑（SB431542，Selleck），α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白（α-SA）小鼠抗人一抗（Santa Cruz，sc-58670），心肌肌鈣蛋白 I（TnI）兔多克隆抗體（abcam，ab47003），波性蛋白（Vimentin）小鼠多克隆抗體（Merck，CBL202），F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗（Merck），HRP 標(biāo)記的兔抗鼠 IgG（Merck），青霉素，鏈霉素，顯微操作儀，倒置顯微鏡，CO2孵育箱。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.2 原代細(xì)胞培養(yǎng) 在DMEM/Highglucose培養(yǎng)液內(nèi)添加 20%FBS、5 μg/ml抗壞血酸鈉溶液、1%ITS（Insulin transferrin selenium）、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔日換液。

1.3.3 樹鼩心肌細(xì)胞的純化 使用梯度貼壁法去除心肌成纖維細(xì)胞。將原代細(xì)胞消化后重懸至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，1.5 h后將細(xì)胞懸液吸至另一個(gè)25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，4 h后將未貼壁細(xì)胞懸液移至另一個(gè)25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。重復(fù)3次做3組平行實(shí)驗(yàn)組，并分別在培養(yǎng)液內(nèi)添加5-溴-2脫氧尿苷（0.1 mM），TGF-β 抑制劑（SB431542，10 μM），阿糖胞苷（2 mg/L）加入其中抑制心肌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。

1.3.4 MTT法測(cè)定心肌細(xì)胞增殖活力 取生長(zhǎng)良好的心肌細(xì)胞，以每孔約2×103個(gè)細(xì)胞等量接種于96孔板中，每孔加入100 μl培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。每隔24 h向其中5孔加入5 g/L的MTT溶液 20 μl，孵育4 h后棄掉培養(yǎng)液，加入 150 μl的 DMSO，置于 37 ℃、5%CO2孵育10 min，每日測(cè)3孔，連續(xù)測(cè)7 d。設(shè)立平行對(duì)照孔（僅加入培養(yǎng)液）并調(diào)零，用酶標(biāo)儀在 490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度值（OD 490 nm），MTT法連續(xù)7 d測(cè)定心肌細(xì)胞增殖及存活能力。

1.3.5 樹鼩心肌細(xì)胞的鑒定

1.3.5.1 心肌細(xì)胞α-SA和TnI抗原鑒定 使用免疫組化的方法鑒定α-SA抗原。取融合至80%以上的心肌細(xì)胞，PBS清洗2次，每次3 min；4%甲醇溶液固定10 min，PBS清洗3次，每次 2 min；0.5%Txiton X-100處理20 min，PBS漂洗3次；3%H2O2溶液室溫處理10 min，滅活內(nèi)源性酶。PBS清洗3次，滴加5%BSA封閉液室溫下20 min，滴加 α-SA單克隆抗體一抗（1∶200），4℃冰箱過夜孵育。PBS清洗3次，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗鼠IgG，37℃濕盒中孵育20 min。PBS清洗4次，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染1 min，室溫吹干封片。心肌成纖維細(xì)胞按上述方法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，作為陰性對(duì)照。

使用免疫熒光的方法鑒定TnI抗原。取融合至80%以上的心肌細(xì)胞，PBS清洗2次；使用4%的甲醛溶液固定20 min，PBS清洗3次（每次2 min）；0.5%的Triton-X100穿孔15 min，PBS漂洗3次；山羊血清封閉液封閉30 min，PBS漂洗3次；加入1%BSA稀釋的心肌肌鈣蛋白I（TnI）兔多克隆抗體一抗（1∶1000），4 ℃過夜，PBS漂洗 3次；加入 1%BSA稀釋的熒光標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶200），37℃孵育1 h，PBS漂洗3次，抗淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。對(duì)成纖維細(xì)胞用相同方法進(jìn)行免疫熒光染色，作為陰性對(duì)照。

1.3.5.2 心肌成纖維細(xì)胞Vimentin抗原的鑒定 使用免疫熒光的方法鑒定Vimentin抗原。取融合至80%以上心肌成纖維細(xì)胞，PBS清洗2次；使用4%的甲醛溶液固定20 min，PBS清洗3次（每次2 min）；0.5%的Triton-X100穿孔15 min，PBS漂洗3次，山羊血清封閉液封閉30 min，PBS漂洗3次；加入1%BSA稀釋的波性蛋白（Vimentin）鼠多克隆抗體一抗（1∶1000），4 ℃過夜，PBS漂洗 3次；加入 1%BSA 稀釋的熒光標(biāo)記的兔抗鼠IgG（1∶200），37℃孵育1 h，PBS漂洗3次；抗淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。對(duì)心肌細(xì)胞用相同方法進(jìn)行免疫熒光染色，作為陰性對(duì)照。

BIM技術(shù)具有三維可視化的特點(diǎn)，是對(duì)建筑及構(gòu)件的直觀表達(dá)。所見即所得的方式提高了理解和溝通的效率，降低了二維圖紙閱讀的專業(yè)性要求，對(duì)于復(fù)雜的空間關(guān)系，如復(fù)雜管線、體型復(fù)雜建筑等來說優(yōu)勢(shì)明顯，如圖2所示。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 剛分離的心肌混合細(xì)胞呈大小不一的球形，培養(yǎng)60 min細(xì)胞開始陸續(xù)貼壁生長(zhǎng)。最先貼壁的為心肌成纖維細(xì)胞，細(xì)胞呈不規(guī)則形或橢圓形，后變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，培養(yǎng)2~3 d觀察，可見明顯增殖，7 d即可呈融合狀態(tài)，細(xì)胞排列緊密，有的交叉重疊生長(zhǎng)，無(wú)自發(fā)性搏動(dòng)，傳至P3代之后會(huì)出現(xiàn)明顯衰老癥狀，細(xì)胞形態(tài)變大，增值速度大幅下降（圖1D）；將90 min后未貼壁的心肌細(xì)胞懸液接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待心肌細(xì)胞貼壁后3 d，換普通培養(yǎng)基替代化學(xué)抑制培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3~5 d，觀察到心肌細(xì)胞增殖緩慢，視野中絕大多數(shù)細(xì)胞為已開始自發(fā)性搏動(dòng)的心肌細(xì)胞。換非化學(xué)選擇性培養(yǎng)液5 d，開始呈現(xiàn)有規(guī)律、不同步搏動(dòng)，7 d后細(xì)胞融合形成細(xì)胞簇或團(tuán)，細(xì)胞呈現(xiàn)同步搏動(dòng)，由周緣向心搏動(dòng)，收縮明顯而有力。見圖1。

2.2 樹鼩心肌細(xì)胞純化比對(duì)結(jié)果 在更換普通培養(yǎng)基后7 d比對(duì)純化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)TGF-β抑制劑不但對(duì)成纖維細(xì)胞有影響，對(duì)心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)同樣有影響。阿糖胞苷的純化效率不高，在后續(xù)的鑒定中發(fā)現(xiàn)使用阿糖胞苷純化的心肌細(xì)胞中混雜有大量的心肌成纖維細(xì)胞。相對(duì)來說，采用梯度貼壁法配合0.1 mM的BrdU在純化心肌細(xì)胞過程中具有良好效果，并且對(duì)于心肌細(xì)胞的損傷較小。

2.3 樹鼩心肌細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果 取采用5-溴-2-脫氧尿苷純化過的心肌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。與心肌細(xì)胞生長(zhǎng)前5 d比較，細(xì)胞活力差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示增殖能力較弱；7~11 d變化較為顯著，提示此段時(shí)間內(nèi)細(xì)胞增殖相對(duì)旺盛，兩兩比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果說明心肌細(xì)胞增殖符合一般細(xì)胞增殖規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)采用的消化法與純化方案對(duì)樹鼩心肌細(xì)胞的增殖沒有顯著影響。見表1。

表 1 BrdU純化后的心肌細(xì)胞活力測(cè)定（n=3，±s）

注：與生長(zhǎng)前 5 d 比較，aP＜0.01

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2.4 樹鼩心肌細(xì)胞鑒定結(jié)果 樹鼩心肌細(xì)胞α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白（α-SA）免疫組化染色結(jié)果呈陽(yáng)性，細(xì)胞質(zhì)被染成褐色，符合樹鼩心肌細(xì)胞的一般特征；對(duì)照組心肌成纖維細(xì)胞呈陰性結(jié)果。見圖2。

樹鼩心肌細(xì)胞TnI免疫熒光染色呈陽(yáng)性，對(duì)照組心肌成纖維細(xì)胞有極個(gè)別細(xì)胞被染色，說明雜有部分心肌細(xì)胞，見圖 3。

樹鼩心肌成纖維細(xì)胞Vimentin免疫熒光染色結(jié)果呈陽(yáng)性，對(duì)照組心肌細(xì)胞染色結(jié)果呈陰性結(jié)果。見圖 4。

3 討論

自20世紀(jì)50年代細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)興起以來，心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)在國(guó)內(nèi)外已有不少報(bào)道，且培養(yǎng)技術(shù)一直不斷改進(jìn)[2-5]。目前，心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于心血管疾病機(jī)理、闡明藥物或毒物的心肌毒性作用機(jī)制，以及心臟組織工程學(xué)等研究[6]。近年來，樹鼩作為一種新型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被廣泛應(yīng)用于各種人類疾病模型的建立。有人認(rèn)為，樹鼩作為低等靈長(zhǎng)類動(dòng)物，有望替代嚙齒類動(dòng)物更好地模擬人的血液病及心腦血管病的發(fā)生和病理進(jìn)程，以及藥物藥效和毒理反應(yīng)等[7]，其中不乏一些成功的模型建立例子，包括Li等[8]利用細(xì)菌脂多糖（LPS）建立的樹鼩敗血癥模型，樹鼩對(duì)LPS的反應(yīng)跟小鼠有較大差異，而與人更為接近；Li等[9]用樹鼩開展腦缺血疾病研究，已成功建立了光誘導(dǎo)樹鼩腦缺血模型。由于樹鼩顱骨很薄，可通過光照射進(jìn)行誘導(dǎo)，使大腦血管形成血栓，造成大腦缺血；加上其大腦發(fā)達(dá)，與靈長(zhǎng)類接近，且經(jīng)濟(jì)、容易飼養(yǎng)，被認(rèn)為是研究腦血管疾病機(jī)制的理想動(dòng)物。這提示我們，利用樹鼩建立各種心血管疾病病理、藥理模型相對(duì)于嚙齒類已有的模型可能會(huì)更具有研究?jī)r(jià)值，更貼近人類的病理、藥理反應(yīng)。但此前并沒有關(guān)于樹鼩心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的報(bào)道，而且以往心肌細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)存在方法復(fù)雜、細(xì)胞活力難以維持[10]、雜質(zhì)成纖維細(xì)胞難以被純化等問題[11]，因此，尋求一種有效、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的適用于樹鼩心肌培養(yǎng)方法，對(duì)心血管疾病機(jī)理、闡明藥物或毒物的心肌毒性作用機(jī)制，以及心臟組織工程學(xué)等研究可能提供重要幫助。

心臟是由心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞組成，其中心肌細(xì)胞約占心臟組織的25%，近75%的細(xì)胞是非心肌細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞和血紅細(xì)胞），心肌成纖維細(xì)胞較心肌細(xì)胞更容易貼壁且具有分裂很強(qiáng)的增殖能力，很容易生長(zhǎng)成優(yōu)勢(shì)細(xì)胞[12]。心臟成纖維細(xì)胞構(gòu)成心肌層絕大多數(shù)的非心肌細(xì)胞，對(duì)心肌功能的正常運(yùn)作起著重要作用。在已報(bào)道的心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)中，分離心肌細(xì)胞的方法主要有機(jī)械收集法[13]和酶消化法[14]。機(jī)械收集法即用吸管反復(fù)吹打達(dá)到分離目的以獲得心肌細(xì)胞，但這種方法的局限性在于吹打的強(qiáng)度難以控制，極易對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷；酶消化法主要通過單一的胰蛋白酶或膠原酶或兩者混合的方法對(duì)細(xì)胞間連接進(jìn)行消化，以達(dá)到分離的目的，但單一高濃度的酶極易損傷細(xì)胞膜及胞內(nèi)的微絲、微管，對(duì)獲得的心肌細(xì)胞造成巨大的損傷。本實(shí)驗(yàn)使用的混合酶主要行使分離作用的是Ⅱ型膠原酶與中性蛋白酶，并將兩者濃度降低到最低限度，在達(dá)到分離目的的同時(shí)最大程度上保護(hù)細(xì)胞免受損傷。

心肌成纖維細(xì)胞的清除一直是心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)所面臨的一個(gè)問題。梯度貼壁法是最常用的一種純化方法[15]，其最大的優(yōu)勢(shì)在于成本低廉，對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷，但這種方法往往純化效率并不高。姜雪松[16]使用了2 mg/L的阿糖胞苷用于SD小鼠心肌成纖維細(xì)胞的純化，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，這種純化方法在體外培養(yǎng)樹鼩心肌細(xì)胞的過程中純化效率有限。此前我們?cè)谂囵B(yǎng)角膜細(xì)胞的過程中發(fā)現(xiàn)，TGF-β抑制劑（SB431542）可以有效抑制雜質(zhì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，但在心肌細(xì)胞的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)這種抑制劑對(duì)樹鼩的心肌細(xì)胞同樣具有很大損傷。本實(shí)驗(yàn)首次橫向比較三種純化方案，并進(jìn)行比較，最后采用了梯度貼壁法聯(lián)合0.1 mM的5-溴脫氧尿苷方法達(dá)到了純化目的，而且對(duì)樹鼩心肌細(xì)胞沒有明顯的損傷。

心肌組織是一種橫紋肌。肌動(dòng)蛋白是橫紋肌肌纖維中的一種主要蛋白成分，也是肌肉細(xì)絲及細(xì)胞骨架微絲的主要成分。肌動(dòng)蛋白具有收縮功能，分布廣泛，在細(xì)胞分泌、吞噬、移動(dòng)、細(xì)胞質(zhì)環(huán)流和細(xì)胞質(zhì)分裂等生命活動(dòng)中起重要作用。α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白（α-SA）的免疫鑒定被廣泛認(rèn)為可以作為心肌細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)[17]。心肌肌鈣蛋白（Tn）是組成橫紋肌細(xì)絲的結(jié)構(gòu)蛋白，可調(diào)節(jié)鈣介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白之間的相互反應(yīng)，本身為多肽，其亞單位I、T和C組成復(fù)合物。其中TnI是肌原纖維ATP酶的抑制單位，可抑制肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，阻止肌肉收縮[18]。心肌肌鈣蛋白作為心肌肌肉收縮的調(diào)節(jié)蛋白，可以作為心肌細(xì)胞特異性鑒定的一個(gè)指標(biāo)。故本實(shí)驗(yàn)用α-SA和TnI單克隆抗體來進(jìn)行免疫組化及免疫熒光標(biāo)記的方法來鑒定心肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果，在α-SA和TnI的雙重鑒定標(biāo)準(zhǔn)之下，基本可以確定我們體外培養(yǎng)的細(xì)胞為心肌細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中并非一貼壁即可產(chǎn)生搏動(dòng)現(xiàn)象，推測(cè)可能是細(xì)胞體外培養(yǎng)初期適應(yīng)新環(huán)境的一個(gè)過程。此外，心肌細(xì)胞相對(duì)于心肌成纖維細(xì)胞來說，增殖能力較差，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)逐步優(yōu)化培養(yǎng)基來應(yīng)對(duì)這種情況，但推測(cè)這也可能是由于心肌細(xì)胞是一種高度分化細(xì)胞，所以其增值能力較差。

本研究通過長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)及多種方法的比較證實(shí)，利用膠原酶Ⅱ與中性蛋白酶聯(lián)合消化心臟組織，通過3次差速貼壁聯(lián)合5-溴脫氧尿苷的使用，能較好地分離純化樹鼩心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞，可以保證細(xì)胞純度較高、細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整及相對(duì)較高的細(xì)胞活力，是一種較為理想的、可以應(yīng)用于樹鼩建立人類心血管病理、毒理細(xì)胞模型的心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞，為日后可能應(yīng)用樹鼩作為心血管疾病病理模型建立良好基礎(chǔ)。

圖1 樹鼩心肌細(xì)胞系形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果（100×）

圖2 樹鼩心肌細(xì)胞α-SA免疫組化染色結(jié)果（100×）

圖3 樹鼩心肌細(xì)胞TnI免疫熒光染色結(jié)果（100×）

圖4 樹鼩心肌成纖維細(xì)胞Vimentin免疫熒光染色結(jié)果（100×）

［1］邸美仙，李應(yīng)東.乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng).中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25：691-692.

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編者·作者·讀者

《傳承國(guó)醫(yī)精華踐行人文精神》——中國(guó)醫(yī)學(xué)人文大會(huì)倡議書（二）

因此，我們向全國(guó)醫(yī)務(wù)工作者提出如下倡議：

作為新中國(guó)新時(shí)代的白衣天使，我們應(yīng)對(duì)讓中華醫(yī)學(xué)之美德與智慧貫穿于育人求學(xué)之全方位、貫穿于醫(yī)患診療之全過程。在中醫(yī)藥現(xiàn)代化、國(guó)際化的今天，我們應(yīng)當(dāng)更加深入挖掘國(guó)醫(yī)精華，錘煉人文品格。把跨越時(shí)空、超越國(guó)度、富有永恒魅力、具有當(dāng)代價(jià)值的文化寶藏弘揚(yáng)起來！

朋友們！同道們！讓我們重溫唐代大醫(yī)“藥王”孫思邈《大醫(yī)精誠(chéng)》中的錚錚誓言，從中汲取能量，砥礪前進(jìn)：

“凡大醫(yī)治病，必當(dāng)安神定志，無(wú)欲無(wú)求，先發(fā)大慈側(cè)隱之心，誓愿普救含靈之苦。若有疾厄來求救者，不得問其責(zé)賤貧富，長(zhǎng)幼妍媸，怨親善友，華夷智愚，普同一等，皆如至親之想；亦不得瞻前顧后，自慮吉兇，護(hù)惜身命。見彼苦惱，若己有之，深心凄愴，勿避艱險(xiǎn)、晝夜、寒暑、饑渴、疲勞，一心赴救，無(wú)作功夫形跡之心，如此可為蒼生大醫(yī)：反此則是含靈巨賊?！?/p>

讓我們共同攜手，為中國(guó)夢(mèng)、中醫(yī)夢(mèng)、健康中國(guó)夢(mèng)的實(shí)現(xiàn)而努力奮斗！

（中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì) 供稿）

Isolation，primary culture and purification of neonatal tree shrew cardiac fibroblasts and cardiac myocytes

MIAO Yu-Run，SONG Qing-Kai，KUANG De-xuan，et al.Center of Tree Shrew Germplasm Resources，Institute of Medical Biology，the Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College，Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infectious Diseases，Kunming 650118，China

ObjectiveTo explore the effective culture conditions and methods of primaryneonatal tree shrew cardiomyocytes，to culture cardiac cells with high purity，and long survival time.MethodsCulturing the cardiomyocytes after purified by the method of different speed adherence for 1.5 hour at 37 ℃ under 5%CO2conditions，then comparing the purification efficiency of bromo-2-deoxy-uridine，cytarabine and TGF-β inhibitor to obtain optimum purification protocol.Cell viability was measured using the MTT assay to determine the feasibility of the method.Immunofluorescence used α-SA and TnI antibody in order to achieve the purpose of identification for cardiomyocytes.Immunofluorescence used Vimentin antibody in order to achieve the purpose of identification for cardiac fibroblasts.ResultsNeonatal tree shrew cardiomyocytes in primary cultured grow well.When observed under inverted microscope，the cells which cultured for 10 days showd connection and began tobeat spontaneously.The MTT assay results showed that the detection of myocardial viability can maintain a good level in 15 d at least.Tree shrew Cardiomyocytes by immunofluorescence staining of α-SA and TnI monoclonal antibodies showed positive.Tree shrew Cardiac fibroblasts by immunofluorescence staining of Vimentin monoclonal antibodies showed positive.ConclusionCardiomyocyteswhich can survive for a long time with high purity can be obtained by this method，is a stable and reliable method of primary cultured tree shrews cardiomyocytes.

Tupaia belangeri； Primary culture； Cardiomyocytes； Cardiac fibroblasts； Authenticate

DAI Jie-jie，E-mail：djj@imbcams.com.cn

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2014BAI01B00）；云南省聯(lián)合支持國(guó)家計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2015GA009）

代解杰，E-mail：djj@imbcams.com.cn

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.10.021

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2017）10-0950-05

2017-02-27）