張杰　張麗麗　李媛媛

摘要：從東北林業(yè)大學(xué)林場(chǎng)土壤中篩選分離出1株六價(jià)鉻[Cr（Ⅵ）]抗性菌株ng 05，經(jīng)形態(tài)、生理生化分析及16S rDNA序列比對(duì)研究其分類；同時(shí)研究反應(yīng)溫度、溶液pH值以及Cr（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度對(duì)該菌去除Cr（Ⅵ）效果的影響，進(jìn)而確定最佳去除條件；此外，利用傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀（FTIR）研究菌株去除的機(jī)制。結(jié)果表明，該菌株為芽孢桿菌屬；最佳反應(yīng)溫度為35 ℃，溶液pH值為9，Cr（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度為5 mg/L，在此條件下可以達(dá)到很好的去除效果，菌株ng 05對(duì)Cr（Ⅵ）的去除效率高達(dá)99%以上；對(duì)比反應(yīng)前后的紅外光譜圖可知，菌體表面的羥基作為電子供體將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ），氨基、羧基、C—H與Cr（Ⅲ）在菌體表面形成絡(luò)合物。

關(guān)鍵詞：Cr（Ⅵ）；芽孢桿菌；抗性菌株；分離篩選；生物去除；機(jī)制研究

中圖分類號(hào)： X172文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2017）16-0268-04

[HJ14mm]

收稿日期：2016-11-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金（編號(hào)：J1210053）；國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31300573）。

作者簡(jiǎn)介：張杰（1972—），女，黑龍江哈爾濱人，博士，副教授，主要從事環(huán)境微生物方面研究。E-mail：zhangjie1972@nefueducn。

通信作者：張國(guó)財(cái)，博士，教授，主要從事環(huán)境微生物和森林保護(hù)方面研究。E-mail：zhang640308@126com。[HJ]

六價(jià)鉻[Cr（Ⅵ）]主要來源于制革、木材防腐、礦石精煉、金屬電鍍和色素沉淀等行業(yè)，隨著工業(yè)廢水的不斷排放，使水體、土壤遭到嚴(yán)重的污染。Cr（Ⅵ）毒性強(qiáng)烈，極易經(jīng)皮膚、呼吸道、消化道以及黏膜侵入人體，損害肝腎等器官，從而嚴(yán)重危害人的身體健康[3]，而Cr（Ⅲ）毒性約為Cr（Ⅵ）的1%[4-5]。傳統(tǒng)上去除Cr（Ⅵ）的方法包括電滲析、化學(xué)沉淀、吸附、反滲透以及離子交換等，但這些方法成本較昂貴，且處理過程中會(huì)造成二次污染的問題。生物法以處理成本低、操作簡(jiǎn)單、不易引起二次污染[8]等優(yōu)點(diǎn)成為去除含Cr（Ⅵ）廢水研究的熱點(diǎn)之一。瞿建國(guó)等篩選出1株抗鉻的脫硫弧菌2-S-8，在營(yíng)養(yǎng)液中加入75 mg/L Cr（Ⅵ），讓該菌在其中生長(zhǎng)，結(jié)果表明，Cr（Ⅵ）的去除率達(dá)到100%[9]；朱玲玲等分離得到1株葡萄球菌（Staphylococcus） Y 73，讓其生長(zhǎng)在Cr（Ⅵ）濃度為1 000 mg/L的培養(yǎng)液中，可以還原83%的Cr（Ⅵ）[10]；Mutter等仔細(xì)研究了處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的假絲酵母活菌對(duì)Cr（Ⅵ）的去除作用，并且研究培養(yǎng)基對(duì)Cr（Ⅵ）的去除效果表明，產(chǎn)朊假絲酵母（Candidautilis）對(duì)Cr（Ⅵ）的吸附量為7 mg/g，且培養(yǎng)基對(duì)Cr（Ⅵ）有還原作用[11-12]。以上研究工作主要偏重于利用培養(yǎng)基中的碳源作電子供體去除Cr（Ⅵ），但在生物去除過程中，培養(yǎng)基中的碳源不僅會(huì)造成二次污染，而且具有成本高、用量需嚴(yán)格控制等弊端。目前，關(guān)于不添加培養(yǎng)基的純菌通過自身生理活動(dòng)直接去除Cr（Ⅵ）的報(bào)道較少，因此本研究擬篩選分離出1株Cr（Ⅵ）抗性菌株，在不添加培養(yǎng)基的條件下，考察環(huán)境因子對(duì)該菌株去除Cr（Ⅵ）效果的影響，并對(duì)其機(jī)制作進(jìn)一步分析和探討，以期為Cr（Ⅵ）生物治理的工業(yè)應(yīng)用提供有益的數(shù)據(jù)。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)從東北林業(yè)大學(xué)林場(chǎng)距地面深20 cm處取土壤樣品，放入無菌封口袋內(nèi)，置于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨，05 g酵母提取物，10 g氯化鈉，100 mL水，調(diào)節(jié)pH值為70。

12試驗(yàn)方法

121菌株的分離純化和篩選本試驗(yàn)稱取5 g采集的土樣，量取5 mL無菌水溶解，攪拌后制成懸浮液。配制好LB培養(yǎng)液，用移液槍吸取1 mL懸液加入150 mL培養(yǎng)液中，用振蕩培養(yǎng)箱于150 r/min富集培養(yǎng)18 h后，對(duì)菌體進(jìn)行馴化培養(yǎng)，篩出可以抗鉻的菌株。先將菌接種于含5 mg/L重鉻酸鉀的培養(yǎng)液中，馴化48 h，逐漸提高重鉻酸鉀的濃度；再將馴化的菌接入含10、15、20、25、30 mg/L重鉻酸鉀培養(yǎng)液中。然后用接種環(huán)蘸取少量菌液，在無菌平板表面進(jìn)行劃線，可在表面得到單菌落，進(jìn)而獲得能在含20 mg/L重鉻酸鉀培養(yǎng)基上存活的菌株，4 ℃保存。

122菌株形態(tài)和生理生化鑒定肉眼觀察記錄菌落形態(tài)，對(duì)菌株ng 05進(jìn)行鑒別染色，利用革蘭氏染色法，觀測(cè)其大小、排列及形態(tài)；采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管對(duì)菌株進(jìn)行硝酸鹽還原反應(yīng)、伏普（V-P）反應(yīng)、甲基紅試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、明膠液化、靛基質(zhì)試驗(yàn)和西蒙氏枸櫞酸鹽利用[13-14]等生理生化特征的測(cè)定。

123菌株16S rDNA序列比對(duì)提取菌株ng 05的基因組DNA，利用細(xì)菌通用引物27 F、1 492 R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 100 s，30次循環(huán)；4 ℃終止。PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行堿基序列測(cè)定。利用NCBI的BLAST進(jìn)行堿基序列比對(duì)，使用MEGA 40軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

124菌株去除Cr（Ⅵ）的影響因素使用LB液體培養(yǎng)基對(duì)菌株ng 05培養(yǎng)24 h（D600 nm=16～17）后，5 000 r/min離心10 min，菌體用生理鹽水洗滌3次，將純菌接入含 5 mg/L Cr（Ⅵ）模擬廢水中，調(diào)整各菌體在廢水中濃度并使其一致，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，振蕩培養(yǎng)24 h，每6 h取樣3 mL，測(cè)定上清液中剩余Cr（Ⅵ）濃度。本試驗(yàn)選擇溫度、pH值、初始 Cr（Ⅵ） 濃度等因素研究菌體去除Cr（Ⅵ）效果。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：pH值5、6、7、8、9、10；反應(yīng)溫度20、25、30、35、40、45 ℃；Cr（Ⅵ） 濃度5、15、25、35、45、55、65 mg/L。

125紅外光譜試驗(yàn)（傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀，簡(jiǎn)稱FTIR）將處理后的菌體制成樣品，在紅外吸收光譜儀上進(jìn)行檢測(cè)并記錄其光譜。

13測(cè)定方法

Cr（Ⅵ）利用紫外-可見分光光度計(jì)，以二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)定[15]。

2結(jié)果與分析

21菌株ng 05鑒定結(jié)果

211菌落形態(tài)及其生理、生化特征從土壤中篩選出1株Cr（Ⅵ）抗性菌株ng 05，該菌株革蘭氏染色后為藍(lán)紫色，為革蘭氏陽性菌，菌體大小為（05～25）μm×（12～100）μm，短桿狀；在瓊脂上，該菌落邊沿整齊，表面光滑濕潤(rùn)，易挑取，白色半透明，菌落正反邊沿與中央顏色一致（圖1）。

由表1可見，菌株ng 05明膠液化試驗(yàn)、伏普（V-P）試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)和甲基紅試驗(yàn)結(jié)果呈陽性，苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)及西蒙氏枸櫞酸鹽利用結(jié)果呈陰性。根據(jù)以上形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果，參照《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊(cè)》，初步判定菌株ng 05為芽孢桿菌。

注：“+”表示示陽性；“-”表示陰性。

21216S rDNA的序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書提取菌株ng 05基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得16 S rDNA序列，長(zhǎng)度為1 514 bp，用BLAST將獲得的16S rDNA序列和GenBank中的所有序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，菌株ng 05與芽孢桿菌屬相似度高達(dá)99%以上，并且經(jīng)MEGA 40軟件構(gòu)建16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）進(jìn)一步分析。根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化特征結(jié)果以及16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果綜合分析，最終將菌株ng 05鑒定為芽孢桿菌屬。

22反應(yīng)溫度對(duì)Cr（Ⅵ）去除的影響

從圖3可以看出，在20～35 ℃下，菌株ng 05對(duì)Cr（Ⅵ）均有不同程度的去除，隨著溫度的升高，去除效率也會(huì)逐漸增大，溫度為35 ℃的條件下效果最佳，去除率可以達(dá)到99%以上，而超過35 ℃后Cr（Ⅵ）去除效率就逐漸下降。因此可知，35 ℃是去除Cr（Ⅵ）的最佳溫度。

由于微生物去除Cr（Ⅵ）的過程是酶促反應(yīng)，在過低的溫度下細(xì)胞膜流動(dòng)性的減弱能夠阻礙運(yùn)輸系統(tǒng)的正常運(yùn)行，使基質(zhì)不能順利進(jìn)入胞內(nèi)供給細(xì)菌而滿足其正常生長(zhǎng)的需求；在過高的溫度下，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生變性，而且是不可逆的，進(jìn)而使去除Cr（Ⅵ）的蛋白酶功能受到損傷，改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)或影響蛋白合成機(jī)制[16]，由此說明，此菌株在溫度35 ℃時(shí)酶促反應(yīng)最佳。

23pH值對(duì)Cr（Ⅵ）的去除效果影響

本試驗(yàn)在pH值5、6、7、8、9、10的范圍內(nèi)研究菌株ng 05對(duì)Cr（Ⅵ）去除的影響。從圖4可以看出，pH值越高，Cr（Ⅵ）的去除效率也更佳，當(dāng)pH值為9時(shí)，Cr（Ⅵ）去除率最大，達(dá)到99%以上，隨后pH值繼續(xù)升高，去除效率則下降。

菌株ng 05去除Cr（Ⅵ）是質(zhì)子消耗過程，因此Cr（Ⅵ）去除效率隨著pH值升高而提高；同時(shí)，菌株ng 05去除Cr（Ⅵ）也是酶促反應(yīng)過程，過高的pH值會(huì)對(duì)蛋白酶的電離率造成影響，使蛋白酶的功能受損，從而影響其活性。因此，選擇合適的pH值對(duì)菌株去除Cr（Ⅵ）至關(guān)重要。由本試驗(yàn)可知，在pH值為9時(shí)，菌株ng 05蛋白酶活性最強(qiáng)，Cr（Ⅵ）去除率也最高。

24不同初始Cr（Ⅵ）濃度對(duì)菌株ng 05去除Cr（Ⅵ）的影響

從圖5可知，Cr（Ⅵ）濃度為5 mg/L時(shí)的去除效果最佳，去除效率達(dá)99%以上；但隨著Cr（Ⅵ）濃度的升高，去除效率也隨之下降。

由于菌株去除Cr（Ⅵ）是酶促反應(yīng)過程，Cr（Ⅵ）濃度的升高，使細(xì)胞表面上的活性位點(diǎn)與鉻離子碰撞的機(jī)會(huì)增大，Cr（Ⅵ） 需求的活性結(jié)合位點(diǎn)很多，進(jìn)而增強(qiáng)了蛋白酶的催化效率，直到滿足限制濃度，達(dá)到飽和狀態(tài)。一旦Cr（Ⅵ）濃度高于限制濃度，菌株去除Cr（Ⅵ）效率就會(huì)隨著金屬離子濃度的增大而降低，所以Cr（Ⅵ）濃度為5 mg/L時(shí)的去除效果最佳。

25紅外光譜分析（FTIR）

由圖6可見，ng05菌株細(xì)胞表面存在多種官能團(tuán)：3 38675 cm-1 處的吸收峰是羥基，2 92645 cm-1處的是 —CH3、—CH2的對(duì)稱和反對(duì)稱的變形伸縮振動(dòng)吸收帶，1 65381 cm-1 處的可能是羧基基團(tuán)中的羰基峰，或者是羰基、氨基的共軛峰；1 40013 cm-1處的吸收峰為—CH3與 —CH2 的彎曲振動(dòng)；1 06769 cm-1處的吸收峰可能是多糖或多糖類似物的C—O鍵和硅酸鹽雜質(zhì)的Si—O鍵伸縮振動(dòng)峰[17]。對(duì)比Cr（Ⅵ）處理前后的FTIR譜，3 38675 cm-1處的羥基吸收峰，加入Cr（Ⅵ）后從3 38675 cm-1處發(fā)生位移至 3 29957 cm-1，吸收峰相對(duì)反應(yīng)前均有很大減弱。

對(duì)于微生物去除Cr（Ⅵ），大部分學(xué)者認(rèn)為是胞外還原作用。Chatterjee等認(rèn)為，細(xì)胞壁表面的—OH與—NH參與 Cr（Ⅵ） 的還原[18]。而Kang等則認(rèn)為，可以通過細(xì)胞表面的—C[FY=，1]O形式吸附Cr（Ⅵ）[19]。在本研究中，結(jié)合Cr（Ⅵ）處[CM（25]理前后菌體的FTIR譜圖分析結(jié)果顯示，吸收峰相對(duì)反應(yīng)[CM）]

前均有很大減弱，說明菌體與Cr（Ⅵ）反應(yīng)后表面的羥基數(shù)量減少，可能是由于羥基作為電子供體，參與了氧化還原反應(yīng)[20]，被還原而得的Cr（Ⅲ）主要形成氫氧化物沉淀或者Cr（Ⅲ）與羧基、羰基形成絡(luò)合物[21]存在于菌體表面。

3結(jié)論

從東北林業(yè)大學(xué)林場(chǎng)土壤中篩選分離出1株Cr（Ⅵ）抗性菌株ng 05，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化分析以及16S rDNA序列比對(duì)鑒定表明，菌株ng 05為芽孢桿菌屬。

不添加培養(yǎng)基的純菌去除Cr（Ⅵ）的效果在35 ℃、pH值為9、初始Cr（Ⅵ）濃度為5 mg/L的條件下效果最佳，去除率達(dá)99%以上。

采用FTIR方法分析可知，在反應(yīng)前后，菌體表面上的羥基作為電子供體將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ），氨基、羧基、C—H與Cr（Ⅲ）在表面形成絡(luò)合物，研究結(jié)果可為Cr（Ⅵ）去除機(jī)制提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

Narayani M，Shetty K VChromium-resistant bacteria and their environmental condition for hexavalent chromium removal：a review[J] Critical Reviews in Environmental Science and Technology，2013，43（9）：955-1009

周宜開 環(huán)境流行病學(xué)基礎(chǔ)與實(shí)踐[M] 北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：249-252

[3]周夢(mèng)芝，王華鋒，鄭月慧，等 常見重金屬污染與男（雄）性不育[J] 中國(guó)公共衛(wèi)生，2013，29（5）：769-772

[4]Xu Y，Zhao D Reductive immobilization of chromate in water and soil using stabilized iron nanoparticles[J] Water Research，2007，41（10）：2101-2108

[5]Petruzzelli D，Passino R，Tiravanti G Ion exchange process for chromium removal and recovery from tannery wastes[J] Water Science & Technology，1995，36（2/3）：197-207

[6]Camargo F A O，Okeke B C，Bento F M，et al Diversity of chromium-resistant bacteria isolated from soils contaminated with dichromate[J] Applied Soil Ecology，2005，29（2）：193-202

[7]Barbooti M M，Ageena N A，Tooma M A Removal of chromium from electroplating wastewater by simple chemical treatment and ion exchange[J] Eng Technol，2008，26：11-13

[8]申如香，瞿建國(guó)，張曉旗，等 微生物法處理冷軋含鉻（Ⅵ）廢水的實(shí)驗(yàn)研究[J] 上?；?，2001（1）：4-6[HJ174mm]

[9]瞿建國(guó)，申如香，徐伯興，等 硫酸鹽還原菌還原Cr（Ⅵ）的初步研究[J] 華東師范大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005（1）：105-112

[10]朱玲玲，曹佳妮，張文，等 一株耐鉻細(xì)菌的鑒定及其還原鉻性能分析[J] 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33（10）：2717-2723

[11]Mutter O，Patmalnieks A，Rapoport A Interrelations of the yeast Candida utilis and Cr（Ⅵ）：metal reduction and its distribution in the cell and medium[J] Process Biochemistry，2001，36（10）：963-970

[12]Muter O，Lubinya I，Millers D，et al Cr（Ⅵ） sorption by intact and dehydrated Candida utilis cells in the presence of other metals[J] Process Biochemistry，2002，38（1）：123-131

[13]布坎南R E，吉布斯E N 伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M] 8版 顏?zhàn)臃f，王海林，譯 北京：科學(xué)出版社，1999：498-501

[14]Gibbons N E伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M] 北京：科學(xué)出版社，1984：482-484

[15]蘇文海 二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)定六價(jià)鉻方法的改進(jìn)[J] 環(huán)境科學(xué)導(dǎo)刊，2009，28（5）：77-79

[16]Narayani M，Shetty K V Chromium-resistant bacteria and their environmental condition for hexavalent chromium removal：a review[J] Critical Reviews in Environmental Science and Technology，2013，43（9）：955-1009[HJ176mm]

[17]宋東濤，李吉進(jìn)，聶俊華，等 膨潤(rùn)土對(duì)土壤腐殖質(zhì)特性的影響[J] 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2008，17（2）：722-726

[18]Chatterjee S，Ghosh I，Mukherjea K K Uptake and removal of toxic Cr（Ⅵ） by Pseudomonas aeruginosa：physic-chemical and biological evaluation[J] Current Science，2011，101（5）：645-652

[19]Kang S Y，Lee J U，Kim K W Biosorption of Cr（Ⅲ） and Cr（Ⅵ） onto the cell surface of Pseudomonas aeruginosa[J] Biochemical Engineering Journal，2007，36（1）：54-58

[20]Krishnani K K，Meng X G，Christodoulatos C Biosorption mechanism of nine different heavy metals onto biomatrix from rice husk[J] Journal of Hazardous Materials，2008，153（3）：1222-1234

[21]Shen Y S，Wang S L，Huang S T，et al Biosorption of Cr（Ⅵ） by coconut coir：spectroscopic investigation on the reaction mechanism of Cr（Ⅵ） with lignocellulosic material[J] Journal of Hazardous Materials，2010，179（1/2/3）：160-165