嚴(yán)偉 劉海寧 宋修剛 姜紅江 高廣凌 秦立武 鞠昌軍 鄒德寶

山東省文登整骨醫(yī)院關(guān)節(jié)科（山東威海 264400）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種中老年人常見的退行性疾病，隨著年齡增長而發(fā)病率逐漸升高，造成的膝關(guān)節(jié)疼痛與功能障礙嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。其病理改變主要為關(guān)節(jié)軟骨磨損、滑膜無菌性炎癥、骨贅形成及軟骨下骨病變等[1]。目前的保守治療主要是對癥治療，包括緩解疼痛、恢復(fù)膝關(guān)節(jié)功能、提高生活質(zhì)量及降低致殘率，常用藥物如非甾體類抗炎藥、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸鈉、長效激素或者鎮(zhèn)痛劑等，但仍沒有有效的藥物能夠阻斷OA的進(jìn)展及逆轉(zhuǎn)軟骨的退變損傷。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）在實驗和臨床方面的研究越來越多，目前已被廣泛應(yīng)用于輕中度甚至重度膝骨關(guān)節(jié)炎動物模型實驗與臨床研究的治療中[2，3]。PRP含有很多高濃度的生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生生長因子（plate?let derived growth factor，PDGF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）等[4，5]。有研究表明，PRP對骨與軟骨再生具有促進(jìn)作用[6]，也有研究證實了PRP可抑制關(guān)節(jié)內(nèi)的炎癥反應(yīng)，延緩OA的進(jìn)程，以緩解癥狀，產(chǎn)生治療作用[7]。PRP中的血小板需要激活劑激活才能釋放各種生長因子[3，4]，并且每次使用均需要抽取新鮮血液進(jìn)行制備，若注射頻次過多勢必會增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和采血的痛苦。為此我們嘗試關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射血小板裂解液（platelet lysate，PL）治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎，通過改良的PRP制備方法，去除了血小板膜和白細(xì)胞等其他細(xì)胞殘片，降低了免疫原性，保留其中的多種細(xì)胞生長因子，這種方法可以單次采血后低溫（-80°C）保存，每次治療前1 h制備PL，經(jīng)體外釋放生長因子并注射在患膝關(guān)節(jié)內(nèi)。本研究旨在探索關(guān)節(jié)腔內(nèi)重復(fù)注射血小板裂解液治療早期膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床療效，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 臨床資料與方法

1.1 一般資料

本研究經(jīng)山東省文登整骨醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署了書面知情同意書。2011年10月至2015年5月于我院就診的106例（141膝）早期膝骨關(guān)節(jié)炎（Kellgren–Lawrence影像學(xué)分級1～2級）[8]患者，其中男性27例，女性79例，患者平均年齡53歲（40～63歲）。從癥狀初次發(fā)作到進(jìn)行本次治療平均時間為8.6個月（3～16個月），治療后患者經(jīng)門診隨訪。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合中華醫(yī)學(xué)會風(fēng)濕病學(xué)分會2010年對KOA的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，Kellgren–Lawrence影像學(xué)分級1～2級，口服抗炎藥物3個月內(nèi)疼痛癥狀無明顯緩解；（2）年齡40～65歲，身高體重指數(shù)（body mass in?dex，BMI）＜30；（3）膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定，髕骨軌跡正常；（4）血常規(guī)及血凝正常，血小板計數(shù)（150～450）×109/L；（5）患膝近2年內(nèi)未做過手術(shù)及其他有創(chuàng)操作。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎；（2）合并嚴(yán)重的髖關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎；（3）膝關(guān)節(jié)大量積液患者；（4）血液疾病、全身性代謝紊亂、免疫缺陷、肝炎患者、HIV陽性的患者；（5）膝關(guān)節(jié)或全身系統(tǒng)感染的患者；（6）1周內(nèi)服用抗血小板藥物的患者；（7）3個月內(nèi)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射激素或者口服激素的患者。

最終納入研究106例（141膝）患者，完成隨訪101例（135膝）患者，膝骨關(guān)節(jié)炎Kellgren–Lawrence影像學(xué)分級1級患者25例（36膝），2級患者76例（99膝）?；颊咭话銧顩r見表1。

表1 患者一般情況

1.2 血小板裂解液制備方法

在生物安全柜中，采用無菌技術(shù)將2500國際單位的低分子量肝素鈉抽入50 mL無菌針管中，制備成肝素化的針管以備靜脈血采集用；患者皮膚消毒后，用肝素化的針管抽取患者大約50 mL的靜脈血；在生物安全柜中將患者靜脈血分裝進(jìn)50 mL的離心管中，使用低溫離心機(jī)在1000 r／min條件下離心20 min，可見全血分為3層，上層為淺黃色的血漿，中層為白色的富血小板血漿，下層為紅細(xì)胞。吸取不帶紅細(xì)胞的中、上層血漿，用3支15 mL的無菌離心管平分約20 mL的上清，于-20℃冰箱內(nèi)短時間保存，-80℃冰箱過夜保存。取出凍存的血漿，在37℃水浴鍋中解凍時間不超過5 min。 反復(fù)凍存融化兩次以上，獲得含多種細(xì)胞生長因子的血清。融化后的血清再以3000 r／min離心6 min，可見血清分為兩層，上層含有多種細(xì)胞生長因子，下層為血小板破碎后的碎片。取上層液，向上層液中按照1000:1體積比例加入濃度為10 μg/mL的強(qiáng)力霉素，過濾加入強(qiáng)力霉素的上層液，抽入5 mL的針管內(nèi)，即得到血小板裂解液（PL），放入黑色無菌樣品袋中備用[5，9]。

1.3 治療方案

患者入院后完善相關(guān)檢查，包括雙膝站立正位片，髕骨運動軌跡片，必要時行MRI檢查（懷疑合并半月板及交叉韌帶損傷），血常規(guī)，血凝常規(guī)，感染性疾病篩查等。

先對患者進(jìn)行宣教，后進(jìn)行PL注射，患者取坐位，雙側(cè)小腿自然下垂，膝關(guān)節(jié)約屈曲90°，嚴(yán)格無菌消毒皮膚，每次注射進(jìn)針點交替選擇髕韌帶內(nèi)外側(cè)膝眼穿刺入關(guān)節(jié)腔，關(guān)節(jié)積液明顯者先抽取積液。注射完畢后用棉球按壓注射部位3～5 min分鐘，至注射點無血液滲出為止。注射完畢后可根據(jù)情況行冰敷以減輕腫脹，囑患者48小時內(nèi)避免劇烈活動。每周注射兩次，5次為1個療程。

1.4 測評方法

于治療前及治療后1個月、3個月、6個月、12個月進(jìn)行西安大略和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)（West?ern Ontario and McMaster Universities Arthritis In?dex，WOMAC）評分，從疼痛、僵硬和關(guān)節(jié)功能三方面來評價膝關(guān)節(jié)功能，采用美國膝關(guān)節(jié)協(xié)會（the Ameri?can Knee Society，AKS）膝評分從疼痛、活動度和穩(wěn)定性方面進(jìn)行評估，并對得分情況進(jìn)行比較，評估療效。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，三組均數(shù)組間比較若符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析；若不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。同組各時間點間計量資料比較采用獨立樣本t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

106例（141膝）患者均完成5次PL膝關(guān)節(jié)腔注射，3例（3膝）患者于隨訪6、7、9個月時因疼痛癥狀不能緩解行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，2例（3膝）患者失訪，101例（135膝）患者完成隨訪，平均隨訪時間15.6個月（12～23個月）。

治療后1個月、3個月、6個月、12個月與治療前相比，每個時間點的WOMAC評分顯著降低（P＜0.01），疼痛減輕，僵硬程度減輕，關(guān)節(jié)功能受限程度降低（表2）。

治療后1個月、3個月、6個月、12個月與治療前相比，每個時間點的AKS評分顯著增高（P＜0.01），治療后患者臨床癥狀明顯減輕，活動度和穩(wěn)定性增加，關(guān)節(jié)功能得到一定程度的恢復(fù)。所有患者治療后均未出現(xiàn)并發(fā)癥，病人滿意度佳。

表2 治療前及治療后1個月、3個月、6個月、12個月WOMAC評分比較

表3 治療前及治療后1個月、3個月、6個月、12個月AKS評分比較

典型病例，王XX，女，56歲，雙膝關(guān)節(jié)疼痛并活動受限半年（圖1），雙膝站立位X線片（圖1B）顯示髁間隆突變尖，內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)間隙狹窄，提示雙膝骨關(guān)節(jié)炎，右膝KL 1級，左膝KL 2級，行血小板裂解液注射5次，連續(xù)隨訪12個月，患者疼痛不適癥狀明顯減輕，膝關(guān)節(jié)功能基本恢復(fù)正常，行站立位X線片檢查（圖1D），關(guān)節(jié)間隙狹窄程度較前減輕。

圖1 典型病例王XX，女，56歲，雙膝關(guān)節(jié)疼痛并活動受限半年

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎是中老年較常見的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病，伴隨疼痛和關(guān)節(jié)運動障礙且以關(guān)節(jié)軟骨退變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特征，關(guān)節(jié)鏡檢查發(fā)現(xiàn)約60%的患者存在不同程度的關(guān)節(jié)軟骨損傷[10-12]，目前常用的治療方法有口服藥物（非甾體抗炎藥、氨基葡萄糖）或中醫(yī)中藥治療、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸（HA）、物理療法和手術(shù)治療。雖然非手術(shù)治療在改善KOA臨床癥狀方面有一定療效，但對延緩關(guān)節(jié)退變進(jìn)展作用較為有限。手術(shù)治療是治療晚期KOA的有效手段，早期KOA還是以保守治療為主，故尋找新的、有效的早期KOA治療方法成為研究熱點[10，13]。

膝關(guān)節(jié)退變主要病理變化包括機(jī)械、細(xì)胞及生化水平的改變，這些因素共同導(dǎo)致了軟骨的合成及力學(xué)性能改變[12]，同時OA的進(jìn)展也受炎性因子及抗炎因子間不平衡的影響，這種不平衡激活了蛋白水解酶，從而損傷軟骨細(xì)胞[12]。軟骨內(nèi)無血管長入，故缺少血液供應(yīng)，當(dāng)受到損傷后愈合速度明顯慢于其他組織。隨著目前組織工程修復(fù)及再生醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明細(xì)胞生長因子在軟骨修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用，而富血小板血漿PRP是通過離心全血分離出的含有高濃度血小板的血漿，其內(nèi)含有的高濃度血小板，可以釋放大量生長因子，故有學(xué)者應(yīng)用PRP來治療軟骨損傷[3，13]。一些臨床研究也已證明PRP能夠促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)[14-16]。這些生長因子如VEGGF、TGF-β等可促進(jìn)局部注射區(qū)域軟骨細(xì)胞膠原蛋白的合成，還可刺激軟骨細(xì)胞分裂，加速血管增生，起到加速創(chuàng)傷部位修復(fù)的作用。還有研究發(fā)現(xiàn)PRP中所含生長因子濃度高，但各因子間的比例接近于體內(nèi)正常比例，而生長因子往往不是直線單一作用，而是相互影響，形成網(wǎng)狀信號通路，這種比例也使得生長因子之間有著最佳的協(xié)同作用，對軟組織有更符合生理的修復(fù)作用[17]。我們改良PRP制備方法，制成血小板裂解液，去除了細(xì)胞成分，尤其是白細(xì)胞，其可能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，僅保留具有活性的細(xì)胞生長因子，從而發(fā)揮更好的修復(fù)作用。

本研究從臨床層面對關(guān)節(jié)腔內(nèi)重復(fù)注射血小板裂解液治療早期膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床療效及機(jī)理進(jìn)行了初步探討，但仍有問題需要進(jìn)一步深入研究。（1）PL促進(jìn)軟骨修復(fù)的最佳濃度尚不清楚，是否濃度越高臨床效果越佳有待進(jìn)一步研究。（2）還需進(jìn)行更長時間的隨訪，明確療效，同時需要更加客觀的評價標(biāo)準(zhǔn)。

總之，對于膝關(guān)節(jié)退變軟骨損傷，PL在修復(fù)及緩解癥狀方面顯示出了獨特的優(yōu)勢和療效。隨著PL制備的簡單、便捷，其應(yīng)用也會越來越廣泛。