姬衛(wèi)秀 毛雅蕓 王林佳 羅琳 張纓

北京體育大學(xué)（北京 100084）

NF-E2相關(guān)因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)靶基因Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表達(dá)[1，2]。在生理狀態(tài)下，Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelchlike ECH-associated protein-1，Keapl）耦聯(lián)，被錨定于胞漿中，并通過泛素化介導(dǎo)Nrf2蛋白降解[3]。運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的活性氧（ROS）可激活Nrf2，使Nrf2與Keapl發(fā)生解偶聯(lián)，并使其從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核與Maf蛋白形成雜化二聚體[4]，而后與下游抗氧化靶基因DNA上的抗氧化元件（ARE）結(jié)合，啟動(dòng)其靶基因的轉(zhuǎn)錄[5，6]。

研究發(fā)現(xiàn)小鼠在急性運(yùn)動(dòng)后骨骼肌和心肌中的Nrf2-ARE結(jié)合活性增加[7，8]。年輕男性在急性運(yùn)動(dòng)后骨骼肌中Nrf2 mRNA水平也出現(xiàn)升高[9]。Horie等使用電脈沖刺激C2C12細(xì)胞模擬急性運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)Nrf2的表達(dá)增加，且與刺激的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)[10]。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，小鼠一次有氧運(yùn)動(dòng)1小時(shí)后，骨骼肌Nrf2-ARE結(jié)合活性和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)量無變化，而一次有氧運(yùn)動(dòng)6小時(shí)后兩者均增加[11]?？梢娂毙杂醒踹\(yùn)動(dòng)增強(qiáng)小鼠骨骼肌Nrf2抗氧化信號(hào)也依賴于運(yùn)動(dòng)的持續(xù)時(shí)間，但其變化機(jī)制并不十分清楚。

因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以Nrf2與Ke?ap1的結(jié)合作用為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探討不同時(shí)間一次有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結(jié)合量、Nrf2和Keap1總蛋白表達(dá)量、Nrf2核蛋白表達(dá)量以及ROS水平的影響，為運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)Nrf2影響骨骼肌抗氧化作用的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

健康8周齡C57BL/6J雄性小鼠（購于維通利華公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCX-K（京）2009-0004，30只，體重18.37 ± 2.26 g，每籠3～4只，飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)動(dòng)物房，動(dòng)物房溫度保持在20～25°C，相對(duì)濕度保持在50%～70%，每天光照12 h（7:00～19:00），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均自由進(jìn)食和飲水。按體重隨機(jī)分為3組，分別是安靜對(duì)照組（0 h組）和一次有氧運(yùn)動(dòng)3小時(shí)組（3 h組）、一次有氧運(yùn)動(dòng)6小時(shí)組（6 h組），每組10只。

安靜對(duì)照組正常飼養(yǎng)不做任何處理，運(yùn)動(dòng)組小鼠進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，跑速為15 m/min（70%VO2max強(qiáng)度），坡度為0。運(yùn)動(dòng)時(shí)間分別為3小時(shí)、6小時(shí)。正式運(yùn)動(dòng)前進(jìn)行2天的適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)。

1.2 取材

在運(yùn)動(dòng)組小鼠運(yùn)動(dòng)結(jié)束后即刻，所有組小鼠脫頸處死，迅速取兩側(cè)腿部骨骼?。ㄓ捎谛∈篌w型小，取腿部所有肌肉），用錫紙包裹標(biāo)記，投于液氮，后轉(zhuǎn)移至－80°C冰箱備后續(xù)之用。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 ROS測(cè)定

小鼠骨骼肌ROS的測(cè)定使用GENMED試劑盒（中國上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，GMS10016.3），采用高質(zhì)熒光進(jìn)行測(cè)定。取100 mg組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.3.2 提取蛋白

提取總蛋白，取100 mg組織，加入800 μl含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，超聲勻漿，冰上靜置30 min，后12000 rpm，4°C離心30 min，取上清溶液即為總蛋白。

提取核蛋白，取100 mg組織，加入800 μl含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液A，超聲勻漿，冰上靜置10 min，振蕩器震蕩5 s，再于冰上靜置10 min，震蕩5 s，然后16000 rpm，4°C離心10 min，棄上清。加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液B，振蕩器震蕩振蕩15 s，冰上靜置10 min，交替進(jìn)行，共振蕩4次，靜置40 min，然后16000 rpm，4°C離心10 min，取上清溶液即為核蛋白。

1.3.3 免疫共沉淀

采用免疫共沉淀法測(cè)組織總蛋白中Nrf2/Keap1的結(jié)合量。將1 ml蛋白濃度為1 μg/μl總蛋白加入到含20 μl Protein A/G Mix Magnetic Beads（美國 Millipore公司，LSKMAGAG02）的離心管中，4°C搖床2 h，將離心管放到磁力架（美國Millipore公司）上，轉(zhuǎn)移上清；向上清中加入5 μl Keap1抗體（sc-33569，santacruz）（In?put中加入Nomal rabbit IgG），4°C搖床過夜；次日加入30 μl Protein A/G Mix Magnetic Beads，室溫?fù)u床 2 h，棄上清，PBS清洗3次，加35 μl上樣緩沖液洗脫，70°C水浴10 min，轉(zhuǎn)移上清液，重復(fù)洗脫第二遍，共吸出上清液70 μl。用Bolt 4%～12%Bis-Tris Plus凝膠（美國life technologies公司）上樣30 μl進(jìn)行電泳。之后采用美國Invitrogen公司的iBlot 2將蛋白從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上。目的條帶標(biāo)記后用5%的脫脂牛奶或BSA封閉1小時(shí)后，加入一抗稀釋液Nrf2（ab62352，1:200）于4°C搖床孵育過夜。次日洗脫一抗后加入相應(yīng)二抗稀釋液室溫?fù)u床孵育1小時(shí)。最后洗脫二抗后加發(fā)光液用BIO-RAD凝膠顯影儀器進(jìn)行顯影。

1.3.4Western Blot

對(duì)提取的組織蛋白（總蛋白和核蛋白）進(jìn)行BCA蛋白濃度測(cè)定（BCA Protein Assay Reagent，美國 Ther?mo Scientific公司），根據(jù)濃度計(jì)算配樣，上樣量為20μg。采用Bolt 4%～12%Bis-Tris Plus凝膠（美國life technologies公司）和NuPAGE MES SDS電泳緩沖液（美國life technologies公司）進(jìn)行電泳。之后采用美國Invitrogen公司的iBlot 2將蛋白從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上。目的條帶標(biāo)記后用5%的脫脂牛奶或BSA封閉1小時(shí)后，進(jìn)行一抗孵育：Nrf2（ab62352，1︰200）、Keap1（sc-33569，1︰500）、總蛋白內(nèi)參β-actin（sc-47778，1︰1000）、核蛋白內(nèi)參H1（sc-1999，1︰1500），于4℃搖床孵育過夜。次日洗脫一抗后進(jìn)行二抗孵育1小時(shí)：Nrf2（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301，1︰2000）、Ke?ap1（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301，1︰5000）、β-actin（羊抗鼠，中科晨宇，164017，1︰5000）、H1（羊抗鼠，中科晨宇，164017，1︰3000）。最后洗脫二抗后加發(fā)光液用BIO-RAD凝膠顯影儀器進(jìn)行顯影，用其配套軟件進(jìn)行條帶檢測(cè)與分析。讀取灰度值，計(jì)算結(jié)果，公式如下：

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)分析方法為單因素方差分析，用P＜0.05和P＜0.01分別表示具有顯著性和非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間一次有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌活性氧（ROS）水平的影響

由圖1可知，與0 h組相比，3 h組小鼠骨骼肌ROS水平略有升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；6 h組小鼠骨骼肌ROS水平顯著性升高（P＜0.05）。3 h組和6 h組之間無顯著差異。

圖1 各組小鼠骨骼肌ROS水平的變化

2.2 不同時(shí)間一次有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2/Keap/1結(jié)合量的影響

由圖2可知，一次有氧運(yùn)動(dòng)3 h、6 h后小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結(jié)合量與0 h組比均顯著降低（P＜0.05），一次有氧運(yùn)動(dòng)兩組之間沒有顯著性變化。

圖2 各組小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結(jié)合量的變化

2.3 不同時(shí)間一次有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2總蛋白、核蛋白表達(dá)的影響

由圖3可知，與0 h組相比，3 h組和6 h組小鼠骨骼肌Nrf2總蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著性增加（P＜0.05），而3 h組和6 h組之間無顯著差異。6 h組小鼠骨骼肌Nrf2核蛋白表達(dá)與0 h、3 h組比均顯著增加（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠骨骼肌Nrf2總蛋白、核蛋白表達(dá)量的變化

2.4 不同時(shí)間一次有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌Keap 1總蛋白表達(dá)的影響

由圖4可知，不同時(shí)間一次有氧運(yùn)動(dòng)后小鼠骨骼肌Keap1總蛋白表達(dá)基本無變化。

圖4 各組小鼠骨骼肌Keap1總蛋白表達(dá)量的變化

3 討論

3.1 不同時(shí)間一次有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌ROS、Nrf2/Keap1結(jié)合作用和Nrf2總蛋白表達(dá)的影響

運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激，可使骨骼肌產(chǎn)生過多的活性分子ROS。當(dāng)生成的ROS超出骨骼肌的清除能力時(shí)，會(huì)造成氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[12]。另一方面，ROS作為信號(hào)物質(zhì)，它的濃度升高可激活Nrf2，促進(jìn)其誘導(dǎo)的抗氧化酶的表達(dá)[13-15]。有研究報(bào)道，運(yùn)動(dòng)除了引起ROS水平升高外，還可引起活性氮（RNS）[16]、一氧化氮（NO）[17]、促炎性物質(zhì)[18-20]等濃度的升高，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)也可激活Nrf2[17，21-23]，進(jìn)而參與抗氧化反應(yīng)。在我們研究中發(fā)現(xiàn)，一次有氧運(yùn)動(dòng)3小時(shí)后小鼠骨骼肌ROS水平略有升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與我們選擇的一次有氧運(yùn)動(dòng)的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度不高有關(guān)。但在該強(qiáng)度下運(yùn)動(dòng)6小時(shí)后小鼠骨骼肌ROS水平出現(xiàn)顯著升高，說明運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間的延長，增加了骨骼肌ROS的產(chǎn)生。

運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的ROS可促進(jìn)原安靜狀態(tài)下細(xì)胞漿中的Nrf2/Keapl復(fù)合物產(chǎn)生解偶聯(lián)作用，生成游離的Nrf2和Keap1[4，13]。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，持續(xù)1小時(shí)以下的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，對(duì)Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)無顯著影響[11，24，25]。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)1小時(shí)跑臺(tái)跑運(yùn)動(dòng)后Nrf2-ARE結(jié)合活性和Nrf2蛋白表達(dá)未出現(xiàn)顯著性變化[11]。因此，在本研究未對(duì)小鼠實(shí)施1小時(shí)一次有氧運(yùn)動(dòng)的觀察。在我們的實(shí)驗(yàn)中一次有氧運(yùn)動(dòng)3小時(shí)和6小時(shí)后發(fā)現(xiàn)，與安靜對(duì)照組（0 h）相比，小鼠骨骼肌的Nrf2/Ke?ap1結(jié)合量均出現(xiàn)顯著降低，游離Nrf2總蛋白表達(dá)顯著增加。說明運(yùn)動(dòng)應(yīng)激促進(jìn)Nrf2/Keapl的解綁作用，除了ROS的激活作用外，可能還有其他物質(zhì)如RNS等的參與[10，16]，但這仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.2 不同時(shí)間一次有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌Keap 1總蛋白表達(dá)的影響

在細(xì)胞漿中Nrf2與Keapl發(fā)生解偶聯(lián)作用，使游離Nrf2蛋白表達(dá)增多的同時(shí)，游離Keapl的量也會(huì)發(fā)生變化[11，26-28]。但在我們研究中卻發(fā)現(xiàn)，3小時(shí)和6小時(shí)的不同時(shí)間一次有氧運(yùn)動(dòng)后小鼠骨骼肌的游離Keap1蛋白表達(dá)并無顯著性變化。推測(cè)這可能與Baird提出的Ke?ap1與Nrf2的相互作用遵循“開放”和“閉合”不同構(gòu)象的循環(huán)方式有關(guān)[29]。“開放”構(gòu)象即為一個(gè)Nrf2分子結(jié)合一個(gè)Keap1分子，而“閉合”構(gòu)象則為一個(gè)Nrf2分子與一個(gè)Keap1二聚體結(jié)合（兩個(gè)Keap1分子）。當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，處于安靜“開放”構(gòu)象狀態(tài)的分子可被誘導(dǎo)呈現(xiàn)為“閉合”狀態(tài)，從“開放”構(gòu)象解綁釋放出的Keap1分子又可重新結(jié)合到“閉合”構(gòu)象，而游離Keap1的分子數(shù)量基本沒有發(fā)生變化[29]。另外，在我們之前的研究中也發(fā)現(xiàn)，四周間歇低氧和低氧訓(xùn)練可改變骨骼肌游離Nrf2的總蛋白表達(dá)量，但同時(shí)對(duì)游離Keap1蛋白表達(dá)無影響[30]。

3.3 不同時(shí)間一次有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌Nrf 2轉(zhuǎn)位入核的影響

通常，轉(zhuǎn)錄因子激活后，需從細(xì)胞漿中轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，識(shí)別與結(jié)合靶基因啟動(dòng)子上的順式作用元件（一段DNA序列），進(jìn)而啟動(dòng)和調(diào)控下游基因的mRNA表達(dá)。因此，Nrf2作為轉(zhuǎn)錄因子，也需進(jìn)入細(xì)胞核與其靶基因上的ARE結(jié)合，從而發(fā)揮Nrf2的抗氧化轉(zhuǎn)錄活性[4]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠一次有氧運(yùn)動(dòng)3小時(shí)和6小時(shí)后，雖然骨骼肌Nrf2總蛋白表達(dá)均顯著增加，但其骨骼肌Nrf2核蛋白表達(dá)僅在6小時(shí)后顯著升高，而3h組無顯著變化。這說明Nrf2從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移入核可能需要一定時(shí)間，會(huì)有一個(gè)延遲效應(yīng)。但這仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

3小時(shí)和6小時(shí)的一次有氧運(yùn)動(dòng)可降低小鼠骨骼肌Nrf2與Keap1的結(jié)合作用，增加游離Nrf2總蛋白表達(dá)，且6小時(shí)的有氧運(yùn)動(dòng)促進(jìn)Nrf2的轉(zhuǎn)位入核。說明一次有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2與Keap1解綁和Nrf2轉(zhuǎn)位入核的影響與運(yùn)動(dòng)時(shí)間的長短有關(guān)。