王少杰 李鵬強(qiáng) 張繼英 王薇 余家闊

1北京大學(xué)第三醫(yī)院運動醫(yī)學(xué)研究所（北京 100191）

2長春理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院

3廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院關(guān)節(jié)外科和運動醫(yī)學(xué)科

關(guān)節(jié)軟骨一旦損傷，其自身修復(fù)能力十分有限，基于細(xì)胞的組織工程手段是一種具有良好前景的軟骨修復(fù)策略。自1987年以來，自體軟骨移植（autologous chondrocyte implantation，ACI）就被用于治療軟骨缺損的治療[1].然而，該技術(shù)存在諸多弊病，例如供區(qū)損傷，可得到的細(xì)胞數(shù)量有限，體外擴(kuò)增軟骨細(xì)胞發(fā)生快速去分化等[2，3]。因此，研究者們積極尋找軟骨細(xì)胞的替代來源作為種子細(xì)胞。因間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchy?mal stem cells，MSCs）的快速增殖以及多向分化能力，來源于不同組織的MSCs得到廣泛重視[4，5]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrow mesenchymalstem cells，BMMSCs）是目前最常用的MSCs，但可獲得的骨髓樣本量少，創(chuàng)傷相對較大。在前期研究中，我們成功從新西蘭大白兔和大鼠的外周血中分離并擴(kuò)增出外周血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（peripheral bloodmesenchymal stem cells，PBMSCs）[6，7]。PBMSCs具有和BMMSCs相似的增殖能力以及多向分化潛能，并且其可以大量微創(chuàng)獲取的特點非常適合臨床應(yīng)用，具有良好的應(yīng)用前景。不僅如此，相比BMMSCs，PBMSCs具有相似的生物學(xué)特性，甚至更強(qiáng)大的成軟骨分化能力[8]。

然而，此前多數(shù)關(guān)于PBMSCs的研究都是基于2D平面培養(yǎng)的結(jié)果，這顯然與細(xì)胞在體內(nèi)所處的3D環(huán)境是不同的。研究者們對PBMSCs在3D多孔支架中的生物學(xué)行為知之甚少。對此方面進(jìn)行深入研究，為后續(xù)研究工作提供更加可靠和具有指導(dǎo)作用的3D微環(huán)境中的生物學(xué)行為，對于組織工程軟骨的設(shè)計和構(gòu)建大有裨益。本研究的主要目的是對PBMSCs在脫礦松質(zhì)骨（demineralizedcancellous bone，DCB）支架中的生物學(xué)行為進(jìn)行深入研究。DCB是組織工程軟骨構(gòu)建中的一種極為常見的生物活性支架。通過將同種異體兔來源的PBMSCs接種到豬DCB支架后，對PBMSCs的形態(tài)、粘附、增殖、成軟骨分化的能力進(jìn)行評估和分析，并與兔來源的BMMSCs以及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞（articular car?tilage chondrocytes，ACCs）進(jìn)行對照分析，以驗證PBM?SCs替代BMMSCs和ACCs作為種子細(xì)胞用于軟骨缺損修復(fù)的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、主要材料、試劑與儀器

實驗所用動物和實驗設(shè)計均通過北京大學(xué)第三醫(yī)院動物倫理委員會論證和批準(zhǔn)，新西蘭大白兔（4周齡，1 kg左右）購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心。AMD3100（Sigma，美國）淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-pa?queTM，1.077 g/mL，美國），兔成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（RBX?MX-90041，賽業(yè)）；Live/Dead 染色試劑盒（Invitrogen，美國），Hoechst 33258木瓜蛋白酶（Sigma，美國），CCK-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）試劑盒（Dojin?do，日本），COL 2酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA）試劑盒（Cloud-clone，美國），激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國），多功能酶標(biāo)儀（Thermoscientific，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1外周血MSC的動員，分離和培養(yǎng)

連續(xù)5天按50 μg/kg的劑量在兔皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF），末次注射24 h后按5 mg/kg的劑量靜脈注射趨化因子受體-4（chemokine receptor-4，CXCR4）拮抗劑AMD3100。在注射AMD3100一小時后，耳緣靜脈取血10 mL加入到含F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液的離心管中離心后吸取富含單個核細(xì)胞的白膜層細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌后重懸于α-MEM完全培養(yǎng)基（含有10%FBS，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，25 ng/mL兩性霉素B，2 mM L-谷氨酰胺），置于37°C含5%CO2和一定濕度的培養(yǎng)箱中孵育。經(jīng)過3～4天后棄去非貼壁細(xì)胞和碎片，此后每3～4天更換完全培養(yǎng)基一次。大約10～15天細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合。收集第4代PBMSCs細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 BMMSCs的分離和原代培養(yǎng)

在麻醉和無菌條件下，從兔髂骨抽吸3 mL骨髓。每份骨髓樣本用1：1 PBS稀釋，同樣以密度梯度離心法分離單核細(xì)胞，PBS洗滌后，重懸于α-MEM完全培養(yǎng)基（含有10%FBS，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，25 ng/mL兩性霉素B，2 mM L-谷氨酰胺），置于37°C含5%CO2和一定濕度的培養(yǎng)箱中孵育。傳代和擴(kuò)增見PBMSCs分離和培養(yǎng)，收集第4代BMMSCs細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 新西蘭大白兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的提取與培養(yǎng)

取3周齡新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)軟骨，含1%雙抗的PBS溶液反復(fù)沖洗后，使用眼科剪剪成1mm3大小的碎片；用0.2%2型膠原酶消化法將軟骨碎片在37°C培養(yǎng)箱內(nèi)消化4～6 h；離心棄上清液，加入DMEM完全培養(yǎng)基（含有10%FBS，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，25 ng/mL兩性霉素B），置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（飽和濕度，5%CO2）。5～7天后，待原代ACCs融合90%以上，使用0.25%胰酶/0.1%EDTA消化，直至細(xì)胞以及軟骨碎片從皿底脫落，使用含 10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。使用P2代ACCs用于后續(xù)實驗。

1.3 支架制備，表征以及與細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)

1.3.1 豬脫礦松質(zhì)骨支架的制備

取家豬膝關(guān)節(jié)股骨遠(yuǎn)端以及脛骨近端，剔除周圍軟組織，自來水沖洗干凈，蒸餾水浸泡；使用電動擺鋸制成厚度1～2 mm的薄片，去除骨碎屑，血塊，以及脂肪組織；5%鹽酸脫鈣7天，蒸餾水洗；濃度為1∶1的甲醇/氯仿液中脫脂48 h，蒸餾水洗；3%雙氧水H2O2中浸泡4 h，蒸餾水洗；采用冷凍干燥機(jī)將DCB凍干48 h；最后用角膜環(huán)鉆裁剪成直徑6 mm，高度2 mm圓柱形支架，60Co消毒備用。

1.3.2 支架表征測定

將支架切成薄片，噴金60 s，然后用掃描電鏡（scanning electronic microscopy，SEM）觀察微觀結(jié)構(gòu)，并隨機(jī)選取DCB電鏡圖片3張，每張圖測定20個孔的最大直徑，采用Image-pro Plus 6.0軟件計算60個孔的平均孔徑。

1.3.3 PBMSCsBMSCs、BMMSCsMMSCs、ACCsACCs和支架材料的復(fù)合和培養(yǎng)

3種細(xì)胞均以相同方法接種，將40 μL（5.0×105cells）細(xì)胞懸液接種到DCB支架上（直徑5 mm，厚度2 mm）。待細(xì)胞充分粘附后，加入含2 mL10%FBS的α-MEM（用于MSCs-DCB復(fù)合培養(yǎng)）或10%FBS的DMEM（用于ACCs-DCB復(fù)合培養(yǎng)）。最后放置在37°C，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天改用兔成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（RBXMX-90041；賽業(yè)）成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3天換液。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)、活性和增殖檢測

1.4.1 細(xì)胞在支架上的分布以及形態(tài)觀察

細(xì)胞DCB支架復(fù)合物在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后取出；PBS洗5分鐘后，入2.5%的戊二醛固定過夜；梯度酒精脫水后臨界點干燥；高度真空中噴金60 s，形成5 nm金涂層；用SEM觀察。

1.4.2 細(xì)胞活性檢測

細(xì)胞DCB支架復(fù)合物在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時后取出；PBS溶液浸洗，Live/Dead工作液中，置于37°C孵育箱中染色60 min；PBS浸洗2遍；在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4.3 CCK- 8測定細(xì)胞增殖

在體外培養(yǎng)的不同時間點，如1、5、7天時，吸凈培養(yǎng)基，PBS浸洗2 min；每個支架加入20 μL的CCK-8以及180 μL培養(yǎng)基，37°C孵育2 h；酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的孵育液吸光度。

1.5 DNA以及細(xì)胞外基質(zhì)分泌含量檢測

1.5.1 DNA以及GAG含量測定

DNA含量測定：體外成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14、21天后，取出支架，濾紙吸干，微量天平稱量濕重；將支架加木瓜蛋白酶裂解液（木瓜蛋白酶125 μg/mL，0.1 M乙酸鈉，5 mM L-半胱氨酸鹽酸，0.05 M EDTA；pH=6.0），眼科剪將支架剪碎，60°C水浴裂解48小時；取支架裂解液，通過Hoechst-33258（2 μg/mL）37°C避光孵育1 h標(biāo)記DNA，酶標(biāo)儀設(shè)定波長360 nm，發(fā)射光波長460 nm測定裂解液熒光強(qiáng)度；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算裂解液的DNA含量。取上述支架裂解液以1，9-二甲基亞甲藍(lán)（dimethylmethyleneblue，DMMB）法測定波長525 nm的孵育液吸光度；用硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）作出濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測支架裂解液的GAG含量；GAG含量與同一樣本支架的DNA含量的比值作為該支架上細(xì)胞分泌GAG含量。

1.5.2 共聚焦顯微鏡檢測COL 2分泌

體外培養(yǎng)3周后，取出支架PBS沖洗，4%多聚甲醛固定60 min；PBS沖洗15 min；10%FBS封閉1 h；小鼠抗兔Ⅱ型膠原抗體4°C過夜孵育，PBS沖洗；Alexa 594標(biāo)記的羊抗小鼠二抗室溫孵育2 h，PBS沖洗，Hoechst-33258工作液500 μL，室溫5 min；激光共聚焦顯微鏡觀測骨特異性基因2型膠原（collagen type 2，COL 2）。

1.5.3 ELISA測定COL 2含量

在體外成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后14和21天時使用Cloud-clone Collagen Type 2 ELISA檢測試劑盒對支架裂解液所含COL 2進(jìn)行定量檢測，操作按說明書進(jìn)行。

1.6 RT-PCRT檢測軟骨分化相關(guān)基因表達(dá)

通過RT-PCR檢測透明軟骨特異性基因聚集蛋白聚糖（aggrecan，AGC），COL 2，纖維軟骨基因1型膠原（collagen type 1，COL 1），成骨基因堿性磷酸酶（alka?line phosphatase，ALP）。利用Trizol提取RNA，按Pro?mega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行mRNA逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增操作，以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95°C變性10 min，95°C15s，60°C 1min，40個循環(huán)，mRNA相對表達(dá)量用2-△△Ct表示。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)誤、方差分析（三組數(shù)據(jù)比較）、Student-t檢驗（兩組數(shù)據(jù)比較）等統(tǒng)計學(xué)分析，當(dāng)P值小于0.05時，差異具有顯著性。

2 實驗結(jié)果

2.1 DCB支架制作及表征測定

電鏡觀察可見DCB具有大量天然的高度聯(lián)通的多孔結(jié)構(gòu)，孔徑范圍137.9～558.1 μm（圖1A），平均孔徑332.3±136.7 μm，平均孔隙率 77.9% ±0.03%（圖1B）。

圖1 支架大體形態(tài)觀察以及掃描電鏡下微觀形貌

2.2 細(xì)胞在DCB支架上的存活，增殖分析

體外培養(yǎng) 24 h后，SEM觀察發(fā)現(xiàn)3種細(xì)胞均在DCB支架的表面以及孔隙的側(cè)壁上緊密貼附，部分區(qū)域可見細(xì)胞成簇分布。PBMSCs與BMMSCs為長梭形或多角形。而ACCs類似鵝卵石樣或多角形（圖2 AC）。體外培養(yǎng) 72 h后，大量細(xì)胞活性良好（圖3AC）。如圖4所示，CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)第1天MSCs數(shù)量多于ACCs，但第5天時3組細(xì)胞的數(shù)量無顯著區(qū)別（P＞0.05），第7天PBMSCs細(xì)胞數(shù)較BMMSCs略增加，但3組細(xì)胞數(shù)較第5天無顯著增加（P＞0.05）。

圖2 掃描電鏡顯示不同細(xì)胞在DCB支架上體外培養(yǎng)24小時后在DCB支架表面形態(tài)

圖3 激光共聚焦顯微鏡顯示細(xì)胞在DCB支架上體外培養(yǎng)72小時后的細(xì)胞活性

圖4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖（n=3）

2.3 細(xì)胞在DCB支架上的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分泌

在體外培養(yǎng)3天后DCB支架上的細(xì)胞DNA含量也逐漸增加。第14天PBMSCs的DNA含量與BMMSCs和ACCs相似（圖5A）。體外培養(yǎng)21天后，兩種MSCs的DNA含量相似，但PBMSCs略高于ACCs組（P＜0.01）。ACCs的GAG早期大量表達(dá)，但體外培養(yǎng)14天后逐漸下降。PBMSCs和BMMSCs的GAG表達(dá)持續(xù)增加（圖5B）。在體外培養(yǎng)14天MSCs的GAG分泌量與ACCs相似，在21天時，MSCs的GAG含量多于ACCs組。在各時間點，PBMSCs和BMMSCs組的GAG含量均無顯著差異。如圖6所示，體外成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后MSCs周圍均出現(xiàn)細(xì)胞外高強(qiáng)度COL 2表達(dá)，且與軟骨細(xì)胞相似。如圖7所示，ELISA法檢測細(xì)胞外基質(zhì)COL 2分泌情況發(fā)現(xiàn)3種細(xì)胞支架在共培養(yǎng)3周過程中COL 2分泌均逐漸增加。接種ACCs的DCB支架分泌COL 2逐漸減少，但COL 2在第21天時仍然高于接種MSCs的DCB支架。

圖5 DNA含量測定（A）和DMMB法檢測GAG含量（B）（n=3）

圖6 支架內(nèi)細(xì)胞體外成軟骨誘導(dǎo)3周后3組細(xì)胞均顯示高強(qiáng)度COL 2表達(dá)

圖7 ELISA法檢測COL 2的分泌含量（n=3）

2.4 基因表達(dá)分析

3組細(xì)胞間的基因表達(dá)在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)14天和21天時均有顯著區(qū)別（圖8）。與14天比較，MSCs組在21天時的透明軟骨特異性基因（AGC，COL 2）表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01），成骨基因 ALP相比升高（P＜0.01）。ACCs組在21天時的透明軟骨基因和成骨基因ALP相比14天顯著下調(diào)（P＜0.01）。MSCs組的纖維軟骨基因COL 1表達(dá)趨勢逐漸增加，而ACCs組表達(dá)趨勢逐漸減少。此外，3種細(xì)胞組之間的基因表達(dá)也有顯著區(qū)別。在成軟骨誘導(dǎo)14天時，PBMSCs和BMMSCs表達(dá)COL 2，AGC，COL 1和ALP的水平仍然顯著低于ACCs（P＜0.05）。在21天時，MSCs組的COL 2和ALP的基因表達(dá)顯著高于ACCs組（P＜0.05）；MSCs組AGC的表達(dá)雖增加，但仍弱于ACCs（P＜0.05）；MSCs的COL 1表達(dá)水平和ACCs無顯著差異（P＞0.05）。

圖8 RT-PCR法檢測3種細(xì)胞COL 2，AGC，COL 1以及ALP的基因表達(dá)含量（n=3）

3 討論

本研究比較了PBMSCs、BMMSCs和ACCs三種細(xì)胞在DCB支架的3D微環(huán)境中的增殖以及成軟骨分化能力。發(fā)現(xiàn)PBMSCs在DCB中維持增殖，且細(xì)胞活性良好；PBMSCs在DCB中可以分化為軟骨細(xì)胞并且分泌大量軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)；在3D培養(yǎng)條件下，PBM?SCs具有與BMMSCs相似的增殖以及向軟骨細(xì)胞分化的能力。目前對于PBMSCs的生物學(xué)行為研究多數(shù)是基于2D平面培養(yǎng)的結(jié)果，本研究對PBMSCs在體外3D微環(huán)境中的細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行詳盡研究，具有創(chuàng)新性。

SEM觀察發(fā)現(xiàn)，3種細(xì)胞均能夠貼附在DCB支架的表面和孔的側(cè)壁。體外培養(yǎng)3天后，共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PBMSCs在DCB上的分布均勻，支架內(nèi)部中也有大量細(xì)胞，死細(xì)胞極少，因此PBMSCs具有BMMSCs和ACCs相似的細(xì)胞活性。此外，CCK-8和DNA含量檢測發(fā)現(xiàn)PBMSCs數(shù)量逐漸增加，上述這些結(jié)果均表明PBMSCs具有良好的生物增殖和軟骨分化能力，同時豬來源的DCB支架具有良好的生物相容性。

DMMB和ELISA檢測結(jié)果表明在成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，PBMSCs和BMMSCs產(chǎn)生的GAG和COL 2逐漸增加，在21天時，GAG含量已明顯高于ACCs；熒光檢測發(fā)現(xiàn)3種種子細(xì)胞分泌的COL 2水平相似（圖6），但ELISA定量檢測結(jié)果表明MSCs組的COL 2的蛋白水平仍然低于ACCs組。此外，干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化伴隨著一系列軟骨特異性基因的表達(dá)，包括COL 2，AGC等。3D環(huán)境中體外成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，外周血和骨髓來源的MSCs都能表達(dá)AGC和COL 2，且AGC表達(dá)水平與ACCs相似，但COL 2的基因表達(dá)水平高于ACCs。因為GAG和COL 2是軟骨基質(zhì)中的重要多糖類物質(zhì)和主要膠原，我們可以認(rèn)為PBMSCs在3D微環(huán)境以及成軟骨誘導(dǎo)因子的雙重作用下成功分化為軟骨細(xì)胞。盡管第21天時PBMSCs和BMMSCs的COL 2基因表達(dá)水平均強(qiáng)于ACCs組，但ELISA結(jié)果提示MSCs的COL 2蛋白表達(dá)水平仍然弱于ACCs組?；虮磉_(dá)和蛋白表達(dá)的不一致可能與此前報道的mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)有關(guān)[9]。例如，miRNAs可以通過對mRNA的降解或者沉默來調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程以及成軟骨過程中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄[10]。此外，本研究中ACCs在21天時仍然分泌更多COL 2可能與我們使用較早代數(shù)的ACCs（P3）有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)在支架中培養(yǎng)的MSCs分泌的COL 2或者AGC與ACCs相似甚至更多[11-14]。這些研究中所采用的軟骨細(xì)胞是骨關(guān)節(jié)炎的ACCs或者體外擴(kuò)增多次的ACCs。

RT-PCR結(jié)果提示ALP和COL 1在體外培養(yǎng)3周后升高，這一現(xiàn)象與MSCs的自發(fā)成骨能力有關(guān)[15]。但纖維軟骨基因COL 1和成骨基因ALP的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于透明軟骨基因COL 2和AGC。與基線水平（第3天）相比，在DCB中成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件下MSCs和ACCs僅有低水平的ALP和COL 1水平的表達(dá)。此外，纖維軟骨基因COL 1和成骨基因ALP的表達(dá)還與材料本身的性質(zhì)有關(guān)。有研究表明材料本身影響細(xì)胞的粘附、生長和分化[16]。COL 1是骨基質(zhì)有機(jī)物的主要成分，也是纖維軟骨的主要成分，被認(rèn)為可以促進(jìn)骨生成[17，18]，因此可能與DCB支架中種子細(xì)胞表達(dá)COL 1和ALP有關(guān)[19-22]。其他材料制作的支架也發(fā)現(xiàn)了這兩種基因的升高[12，23，24]，這提示在體外條件下維持MSCs或者ACCs的軟骨細(xì)胞表型，杜絕軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大或者分化成為成骨細(xì)胞還需要更多深入的研究。

兩種來源的MSCs在DCB支架中進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)未顯示明顯成軟骨特性的差異，這可能與PBMSCs是由骨髓中的MSCs動員而來[25]，而且3D的細(xì)胞培養(yǎng)條件比平面培養(yǎng)更能模仿體內(nèi)的微環(huán)境[26，27]有關(guān)。不同的3D微環(huán)境對MSCs的成軟骨能力也有影響[28，29]，還需要更多的比較研究進(jìn)一步評價在不同的3D支架中，PBMSCs增殖和成軟骨能力的變化。

DCB是常用的軟骨組織工程的3D培養(yǎng)支架[21，30]；相對于同種異體骨而言，豬來源的DCB更加廣泛和易于獲取，也更有可能應(yīng)用于臨床，因此，在本研究中我們選取了豬來源的DCB。DCB的主要成分是COL 1，經(jīng)過脫蛋白處理后其抗原表面決定簇被破壞，不會導(dǎo)致免疫反應(yīng)[31]，3種細(xì)胞和DCB之間良好的生物相容性提示DCB是一種安全的生物活性材料，具有良好的組織工程軟骨應(yīng)用前景。

本研究主要在天然材料DCB中進(jìn)行，還存在一些不足之處。PBMSCs在其他材料制備的支架，如高分子支架中的生物學(xué)特性還需要進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

外周血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在異種脫礦松質(zhì)骨支架中具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的良好的增殖和成軟骨能力，但體外培養(yǎng)條件下依然存在肥大軟骨細(xì)胞基因表達(dá)的現(xiàn)象，需要對培養(yǎng)條件進(jìn)一步優(yōu)化。鑒于外周血來源廣泛，可微創(chuàng)獲取，因此外周血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以作為一種極具應(yīng)用前景的新型種子細(xì)胞用于組織工程軟骨構(gòu)建。