崔海鵬 劉凱 林映雪 張乘云 趙娟

【摘要】目的：探討Ras癌基因誘導(dǎo)的miR-182-96-183高表達(dá)機(jī)制。方法：采取H-ras12V轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌及癌旁組織，miRNA高通量測(cè)序檢測(cè)miR-182-96-183基因表達(dá)水平。Wes ternblot檢測(cè)調(diào)控miR-182-96-183表達(dá)的相關(guān)信號(hào)通路活化狀態(tài)及其上游轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：miRNA高通量測(cè)序結(jié)果表明：與PT相比，T中m1R-182-96-183mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01）。Wes ternblot檢測(cè)結(jié)果表明：與PT相比，T中ERK、mTOR活化水平顯著升高，SREBP-lc蛋白水平顯著升高。結(jié)論：Ras癌基因可能通過(guò)活化mTOR通路激活SREBP-1c上調(diào)miR-182-96-183的表達(dá)水平。

【關(guān)鍵詞】肝癌；miR-182-96-183：Ras：mTOR：SREBP-1c

Ras信號(hào)通路激活在肝癌中普遍存在[1]。miRNAs可通過(guò)抑制其靶基因的翻譯在癌癥的發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色[2]，同時(shí)有研究表明miR-182-96-183家族在多種原發(fā)性腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。我們前期進(jìn)行的miRNA高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)miR-182-96-183在肝癌組織中顯著表達(dá)，但其在Ras誘導(dǎo)的肝癌中高表達(dá)機(jī)制尚不清楚。本研究利用H-ras12V轉(zhuǎn)基因肝癌小鼠模型[4]初步探討了miR-182-96-183在肝癌中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)H-ras 12V轉(zhuǎn)基因小鼠，雄性，9月齡，體重30～40g，大連醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。生產(chǎn)許可證SCXK（遼）2016-0003，使用許可證SYXK（遼）2016-0006。

1.1.2試劑

抗體p-ERK、p-mTOR、SREBP-1c購(gòu)自Cell Signal公司。

1.1.3儀器

BG-blotMINI垂直轉(zhuǎn)印儀等。

1.2方法

1.2.1組織樣本的采集

分別采取轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌和癌旁組織，迅速液氮冷凍保存。

1.2.2 miRNA高通量測(cè)序

組織樣本送至晶能生物公司進(jìn)行Illumina miRNA測(cè)序。具體方法參見文獻(xiàn)。

1.2.3 Westemblot檢測(cè)

45μg蛋白10%SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育過(guò)夜。二抗孵育1h，顯影，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x土s表示，Shapiro-Wilk法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，根據(jù)Levene方差齊性檢驗(yàn)，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1基因芯片檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織miR-182-96-183表達(dá)水平

高通量miRNA表達(dá)測(cè)序分析如表1，H-ras12V轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌旁組織miR-96、miR-183表達(dá)值為0，在肝癌組織中表達(dá)量顯著增高（P<0.01），miR-182在肝癌組織中表達(dá)量顯著高于癌旁組織（P<0.01）。

2.2 ERK、mTOR、SREBP-1c表達(dá)水平檢測(cè)

如圖1所示，與癌旁組織相比，肝癌組織中p-ERK、p-mTOR、SREBP-1c蛋白表達(dá)顯著升高。

3討論

miRNA是一類長(zhǎng)度約為22nt的非編碼單鏈小分子RNA，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控[6]。有研究表明，腫瘤的發(fā)生伴隨miRNAs特異性表達(dá)[2]。為了探究Ras癌基因誘導(dǎo)肝癌發(fā)生過(guò)程中miRNAs的表達(dá)變化，采用高通量測(cè)序?qū)-ras12V轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織miRNAs表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，肝癌組織中miR-182-96-183顯著升高（表1）。

miR-182-96-183是由同一染色體轉(zhuǎn)錄經(jīng)初體、前體剪切修飾生成的3個(gè)成熟體miRNA[3]，可抑制下游靶基因的翻譯發(fā)揮關(guān)鍵作用。大量研究表明，miR-182-96-183的高表達(dá)在肝硬化、肝癌中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]，有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT/mTOR可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子SREBP可直接調(diào)控miR-182-96-183的轉(zhuǎn)錄[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在肝癌中mTOR活化水平顯著增高，轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c表達(dá)顯著增高（圖2）。由此推測(cè)：Ras誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生中可能通過(guò)PI3K/AKT/mTOR誘導(dǎo)SREBP-1c促進(jìn)miR-182-96-183的表達(dá)。

綜上所述，Ras癌基因可協(xié)同mTOR/SREBP-1c上調(diào)miR-182-96-183表達(dá)。但其確切分子機(jī)制有待被進(jìn)一步證明。

（通訊作者：趙娟）

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