張迪夏 薇蘆瑤

【摘要】目的：比較含12%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基與含12%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG-2細(xì)胞的效果。方法：采用舍12%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基與含12%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG-2細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞的貼壁情況，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果：含12%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)更好，細(xì)胞的存活率更高。結(jié)論：在對(duì)HepG-2細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)建議首選含12%新生牛血清的RPMI-1640。

【關(guān)鍵詞】DMEM； HepG-2；RPMI-1640

當(dāng)前大部分學(xué)者在對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)通常選用PRMI-1640培養(yǎng)液或DMEM培養(yǎng)液，故在對(duì)HeoG-2細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)也可應(yīng)用PRMI-1640培養(yǎng)液或DMEM培養(yǎng)液。但已有研究發(fā)現(xiàn)[1]：由于PRMI-1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基中各成分不同，尤其是氨基酸，維生素和葡萄糖的含量差別很大，因此對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)狀態(tài)產(chǎn)生一定影響。在體外細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的好壞和細(xì)胞生長(zhǎng)速度的快慢等方面與細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇有著密不可分的聯(lián)系。已有研究表明：在細(xì)胞培養(yǎng)基的制備過(guò)程中，需要在培養(yǎng)基中添加一定含量的生物性液體或組織提取液才能支持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，由于血清中含有天然促生長(zhǎng)因子，可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁，因此成為被廣泛采用的培養(yǎng)基添加物，最常用的為新生牛血清[2]。趙翔[3]等人在研究PRMI-1640和DMEM培養(yǎng)基中對(duì)Hep G2的影響時(shí)并沒(méi)有充分考慮到血清濃度對(duì)于HepG-2細(xì)胞的影響，選用的為濃度為10%新生牛血清并且沒(méi)有加入一定量的雙抗。但已有研究表明由于人肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)緩慢，惡性程度較高，因此對(duì)于血清的要求比較嚴(yán)格，其培養(yǎng)時(shí)所需要新生牛血清的濃度要比一般的腫瘤細(xì)胞高一些。因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PRMI-1640和DMEM培養(yǎng)基加入12%新生牛血清和0.5%的雙抗對(duì)Hep G2人肝母細(xì)胞瘤進(jìn)行培養(yǎng)。希望為選擇適合于Hep G2細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

（1）HepG-2細(xì)胞株由北華大學(xué)提供；

（2） RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；

（3）新生牛血清購(gòu)于杭州四季青公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞復(fù)蘇

從液氮箱中取出凍存管，快速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞間，放入37攝氏度恒溫水浴箱中進(jìn)行均勻搖晃，盡量讓細(xì)胞在1分鐘內(nèi)解凍。解凍后使用含75%的酒精噴灑凍存管的管口和管身對(duì)凍存管進(jìn)行消毒。消毒后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行復(fù)蘇。將凍存管內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至15ml離心管內(nèi)，700轉(zhuǎn)/min進(jìn)行離心，離心后，吸去上清。

1.2.2培養(yǎng)基的選擇

方法一：1640培養(yǎng)液

取1640培養(yǎng)粉215.6g和碳酸氫鈉39溶解于1170ml高壓滅菌的雙蒸水當(dāng)中，用磁力攪拌器攪拌至其完全溶解，用1mol/1NaCl將PH調(diào)至7.2，定容至1.5L，過(guò)濾除菌后4攝氏度進(jìn)行保存。吸去上清后加入30ml含12%新生牛血清和0.5雙抗的1640培養(yǎng)基，用移液槍小心吹打細(xì)胞混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔5ml，共6孔，放入5%CO₂，溫箱37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

方法二：DMEM培養(yǎng)液

取DMEM培養(yǎng)粉20.1g溶解于1200ml高壓滅菌的雙蒸水當(dāng)中，用磁力攪拌器攪拌至其完全溶解，向溶液中加入碳酸氫二鈉5.55g，繼續(xù)攪拌至其完全溶解，用1mol/l氯化鈉將PH調(diào)至7.2，混合均勻后，定容至1.5L，過(guò)濾除菌后4攝氏度進(jìn)行保存。吸去上清后加入30ml含12%新生牛血清和0.5%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，用移液槍小心吹打細(xì)胞混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔5ml，共6孔，放入5%CO₂，溫箱37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3細(xì)胞換液

取出培養(yǎng)箱中的細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。吸棄廢液，用PBS進(jìn)行洗滌三次，再用細(xì)胞液進(jìn)行洗滌1次，兩組各加入含有12%的新生牛血清的1640培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液。

1.2.4細(xì)胞傳代

待細(xì)胞貼壁情況達(dá)至80-90%時(shí)并且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)可以進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。小心吸棄廢液，用PBS進(jìn)行洗滌三次，再用細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行洗滌一次。加入0.25%胰酶進(jìn)行消化，放入培養(yǎng)箱中每隔2min進(jìn)行鏡下觀察一次，待細(xì)胞變圓后可輕輕拍打培養(yǎng)盤(pán)，待貼壁細(xì)胞大部分下來(lái)后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，用尖吸頭吹打細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至離心管中，700轉(zhuǎn)/min離心5min，小心吸棄廢液，加入一定量的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行吹打混勻，大約吹打50-100次后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中。

1.2.5細(xì)胞形態(tài)觀察

各組細(xì)胞分別培養(yǎng)12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h后在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，觀察細(xì)胞貼壁情況，細(xì)胞的生長(zhǎng)程度，有無(wú)細(xì)胞碎片或死細(xì)胞。

1.2.6細(xì)胞計(jì)數(shù)

酒精棉球擦蓋玻片，將其放在計(jì)數(shù)板的槽上。將PBS與臺(tái)盼蘭按照1：1組成混合液。取9ul細(xì)胞懸液和9ul混合液混合均勻于1.5ml離心管中，蓋上蓋玻片，取12ul混合液自血球計(jì)數(shù)盤(pán)上方加入，于10倍顯微鏡下進(jìn)行觀察，活細(xì)胞不著色，著色呈藍(lán)色的為死細(xì)胞。分別計(jì)數(shù)落在計(jì)數(shù)盤(pán)上四個(gè)大方格上的細(xì)胞數(shù)量，將4個(gè)大方格上數(shù)量相加得到細(xì)胞的總數(shù)量，除以4，乘以稀釋倍數(shù)，最后乘以10000，即為每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)

RPMI-1640與DMEM培養(yǎng)液（含12%新生牛血清）培養(yǎng)細(xì)胞24h后，兩組細(xì)胞均部分貼壁，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，上層有少許未貼壁的細(xì)胞，并沒(méi)有特別大的差別。在細(xì)胞培養(yǎng)48h后，在RPMI-1640培養(yǎng)液中的細(xì)胞飽滿、細(xì)胞呈堆積生長(zhǎng)，單個(gè)細(xì)胞形態(tài)不明顯。細(xì)胞堆積后呈梭形或多邊形，多數(shù)細(xì)胞呈分裂狀態(tài)。培養(yǎng)60h后RPMI-1640培養(yǎng)液中細(xì)胞狀態(tài)尚可，72h后出現(xiàn)少許黑色顆粒疑似死細(xì)胞，細(xì)胞液開(kāi)始出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。但貼壁情況和其他細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，84h開(kāi)始出現(xiàn)死細(xì)胞。培養(yǎng)48h后，DMEM培養(yǎng)液中開(kāi)始出現(xiàn)黑色顆粒疑似死細(xì)胞，細(xì)胞也呈堆積生長(zhǎng)，但堆積的貼壁細(xì)胞中有圓圓的透明顆粒，細(xì)胞液開(kāi)始出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。72h后DMEM培養(yǎng)液中出現(xiàn)明顯死細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)稍差。

2.2細(xì)胞數(shù)量

RPMI-1640與DMEM完全培養(yǎng)液（含12%新生牛血清）培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況以培養(yǎng)時(shí)間為橫座標(biāo)，以細(xì)胞量（×10000）為縱座標(biāo)進(jìn)行繪圖，見(jiàn)圖1。

3討論

原發(fā)性肝癌具有發(fā)病率高和死亡率高等特點(diǎn)，其中50%發(fā)生在我國(guó)，由于治療困難，因此死亡率也一直居高不下，嚴(yán)重威脅到了我國(guó)人民群眾的生活和健康，因此對(duì)其研究勢(shì)在必行。

細(xì)胞在體外得以生長(zhǎng)、增殖需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氨基酸，因此培養(yǎng)基的選擇是體外細(xì)胞培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基是由Moore等人于1967年研制，含21種氨基酸和維生素11種等。DMEM是由Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，DMEM含有14種氨基酸和多種維生素。其中葡萄糖含量為4500mg/L。

從細(xì)胞培養(yǎng)的情況來(lái)看，在含有12新生牛血清和0.5雙抗的DMEM培養(yǎng)液中HepG-2細(xì)胞在48 h內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好貼壁狀態(tài)良好，但48h后細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。在含有12新生牛血清和0.5雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中HepG-2細(xì)胞24h后的貼壁情況和細(xì)胞數(shù)量明顯優(yōu)于DMEM培養(yǎng)液中的細(xì)胞，并且出現(xiàn)死亡細(xì)胞的時(shí)間明顯長(zhǎng)于DMEM培養(yǎng)液中的細(xì)胞。

由于DMEM中含有大量的葡萄糖，RPMI-1640含有大量的氨基酸和維生素，而氨基酸和維生素種類(lèi)更多的培養(yǎng)液更有益于細(xì)胞生長(zhǎng)，而由于腫瘤細(xì)胞惡性程度比較高，因此選用血清濃度較高的RPMI-1640培養(yǎng)液更有助于HepG-2細(xì)胞的生長(zhǎng)。

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