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        江西省首起聚集性人感染H7N9禽流感實(shí)驗(yàn)室診斷與分析

        2017-10-21 05:46:15孫愛(ài)猛王平興周信云劉麗吳珺朱端昊
        關(guān)鍵詞:禽流感流感核酸

        孫愛(ài)猛,王平興,周信云,劉麗,吳珺,朱端昊

        (吉安市疾病預(yù)防控制中心,江西 吉安 343000)

        ·調(diào)查報(bào)告·

        江西省首起聚集性人感染H7N9禽流感實(shí)驗(yàn)室診斷與分析

        孫愛(ài)猛,王平興,周信云,劉麗,吳珺,朱端昊

        (吉安市疾病預(yù)防控制中心,江西 吉安 343000)

        目的 通過(guò)real-time RT-PCR對(duì)江西省首起聚集性人感染H7N9禽流感病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷與分析,進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室對(duì)人感染禽流感的檢測(cè)能力。方法 采集人感染H7N9禽流感病例咽拭子并提取RNA,分別采用流感甲/乙型通用引物、季節(jié)性流感特異性引物(H1N1、H3N2、H1N1pdm)、禽流感特異性引物(H5、H7、N9、H9、H10)進(jìn)行 real-time RT-PCR 檢測(cè)。結(jié)果 患者A甲型流感、禽流感H7、N9核酸擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性;患者B(患者A的母親)甲型流感、禽流感H7核酸擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性。結(jié)論 經(jīng)江西省疾控中心流感實(shí)驗(yàn)室復(fù)核,患者A與患者B均感染H7N9禽流感病毒,為江西省首起人感染H7N9禽流感病毒聚集性病例。

        禽流感H7N9;聚集性病例;實(shí)驗(yàn)室診斷

        2013年3月,我國(guó)東部地區(qū)出現(xiàn)不明原因重癥肺炎病例,后經(jīng)國(guó)家流感中心確證為新型人感染H7N9禽流感病例[1]。流感病毒為單股負(fù)鏈RNA病毒,基因組大小約為 14kb,由 HA、NA、NP、PA、PB1、PB2、M、NS八個(gè)片段所組成。研究表明新型H7N9禽流感病毒是由多種禽流感病毒重配所產(chǎn)生的,其HA基因可能來(lái)自于野鴨中的禽流感H7N3,NA基因來(lái)自于東亞遷徙候鳥(niǎo)中的禽流感H7N9,余下六個(gè)片段來(lái)自于禽流感 H9N2[1,2]。 人感染H7N9禽流感引起的臨床癥狀主要有高熱、咳嗽、肌肉酸痛、呼吸窘迫進(jìn)而導(dǎo)致重癥肺炎[1,3];聚集性病例的出現(xiàn)提示新型禽流感病毒在人際間可能進(jìn)行有限的傳播[4-7]。目前針對(duì)其檢測(cè)方法主要有分子生物學(xué)檢測(cè)、血凝抑制試驗(yàn)與病毒培養(yǎng)等[8];本研究對(duì)江西省2例輸入性不明原因肺炎患者咽拭子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),最終確診兩位患者為人感染H7N9禽流感聚集性病例,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 患者基本情況患者A,男,23歲;患者B,43歲,兩者為母子關(guān)系。2016年4月8日前均居住在福建某地;2016年3月25日患者A在活禽市場(chǎng)有購(gòu)買(mǎi)禽肉史,禽肉為現(xiàn)宰現(xiàn)賣(mài),且當(dāng)天患者A、B均有禽肉加工史。患者A于2016年4月1日發(fā)病,患者B于2016年4月5日發(fā)病,發(fā)病后在當(dāng)?shù)卦\所接受治療,2016年4月8日兩例患者由福建返回江西繼續(xù)接受治療。

        1.1.2 樣本 2016年4月15日以不明原因肺炎病例采集兩例患者咽拭子樣本低溫送至吉安市流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。兩例患者經(jīng)上級(jí)部門(mén)確證為人感染H7N9禽流感病例后按照人感染H7N9禽流感疫情防控方案(第三版)開(kāi)展聚集性病例的強(qiáng)化監(jiān)測(cè),采集密接者等人群咽拭子標(biāo)本低溫送至吉安市流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

        1.1.3 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒、A/B流感通用型核酸檢測(cè)試劑盒、季節(jié)性流感檢測(cè)試劑盒(H1N1、H3N2、H1N1pdm)、禽流感核酸檢測(cè)試劑盒(H5、H7、N9、H9、H10) 均購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因公司,所有試劑均在有效期內(nèi)。

        1.1.4 主要儀器 ABI7300熒光PCR儀、振蕩器等

        1.2 方法

        1.2.1 病毒核酸提取提取病毒核酸在生物安全I(xiàn)I級(jí)(BSL-2)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行,提取方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

        1.2.2 Real-time PCR檢測(cè)甲/乙型流感、季節(jié)性流感 (H1N1、H3N2、H1N1pdm)、 禽流感(H5、H7、N9、H9、H10)核酸檢測(cè)及判定標(biāo)準(zhǔn)均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。擴(kuò)增條件均為:50℃ 15min,1 cycle;95℃,15min,1 cycle;94℃,15s~58℃,45s,45 cycle。

        1.2.3 質(zhì)量控制陰性質(zhì)控品無(wú)明顯擴(kuò)增曲線(xiàn);陽(yáng)性質(zhì)控品有明顯擴(kuò)增曲線(xiàn),且Ct值≤30;以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿(mǎn)足,否則本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。陰陽(yáng)性質(zhì)控品由試劑盒自帶。

        2 結(jié)果

        2.1 患者咽拭子檢測(cè)結(jié)果使用通用型甲/乙流感、季節(jié)性流感 (H1N1、H3N2、H1N1pdm)、 禽流感(H5、H7、N9、H9、H10) 核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)提取的病毒核酸進(jìn)行real-time PCR檢測(cè),結(jié)果為患者A甲型流感、禽流感H7、N9核酸擴(kuò)增結(jié)果均陽(yáng)性;患者B甲型流感、禽流感H7核酸擴(kuò)增結(jié)果均陽(yáng)性,其余均為陰性,擴(kuò)增結(jié)果及Ct值見(jiàn)表1和圖1~3。

        2.2 密接者及強(qiáng)化監(jiān)測(cè)結(jié)果對(duì)采集密接者及強(qiáng)化監(jiān)測(cè)的55份咽拭子樣本進(jìn)行real-time PCR進(jìn)行檢測(cè),共檢測(cè)到乙型流感14份,甲型流感通用性核酸檢測(cè)均為陰性。

        表1 H7N9 real-tim e PCR檢測(cè)結(jié)果

        圖1 甲型流感核酸通用性檢測(cè)

        圖2 新型H7N9 H7亞型檢測(cè)

        圖3 新型H7N9 N9亞型檢測(cè)

        3 討論

        病毒侵入宿主細(xì)胞需要借助宿主細(xì)胞受體才能完成,流感病毒HA受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列決定了病毒對(duì)禽與人的結(jié)合傾向。禽流感病毒在禽類(lèi)中的宿主受體為SAα-2,3 Gal受體,人上呼吸道黏膜上皮細(xì)胞以SAα-2,6 Gal受體為主,下呼吸道以 SAα-2,3Gal受體為主[9],以往有研究表明禽流感H7能夠感染人引起輕微的呼吸道癥狀[10],N9感染人尚屬首次;從禽類(lèi)和人分離到的H7N9病毒在 HA區(qū)域存在G186V、Q226L、A138S氨基酸替換,這可能導(dǎo)致禽流感對(duì)人宿主受體結(jié)合力的增加,從而導(dǎo)致跨種屬傳播的發(fā)生[11]。Ding H等人研究證明新型H7N9禽流感病毒在人際間可能存在有限的人際間傳播[4-7];本研究中患者A、B雖然均有禽肉加工史,但并不能完全排除人際間傳播的可能性,需要進(jìn)一步的排除與驗(yàn)證。研究證明H7N9禽流感PB2蛋白發(fā)生Q591R和E627K能夠明顯增強(qiáng)對(duì)小鼠的致病性以及病毒在哺乳動(dòng)物的適應(yīng)性[12]。郭曉蘭在對(duì)人感染H7N9禽流感輕重病例病毒全基因組序列分析中發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)E627K突變存在差異[11];與以往人感染H7N9發(fā)生重癥肺炎多見(jiàn)于年齡偏大的患者不同,患者A為青年患者且自身無(wú)基礎(chǔ)性疾病,4月8號(hào)收治入院后立即使用達(dá)菲開(kāi)始治療,4月15日因病情持續(xù)加重轉(zhuǎn)上級(jí)醫(yī)院繼續(xù)治療,分析導(dǎo)致該患者病情加重的原因可能為病毒毒力基因發(fā)生改變,從而導(dǎo)致為致病力增強(qiáng)[13]。下一步需要對(duì)病毒相關(guān)序列進(jìn)行測(cè)序,并對(duì)其耐藥性基因及毒力基因進(jìn)行分析。

        研究表明人感染H7N9禽流感檢測(cè)過(guò)程中下呼吸道樣本的陽(yáng)性檢出率要高于上呼吸道[14];本研究中兩例樣本real-time PCR檢測(cè)的Ct值均接近判斷閾值,其主要原因可能是樣本來(lái)自于上呼吸道,且患者發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng),此時(shí)上呼吸道樣本中病毒拷貝數(shù)偏低;這提示在后期日常傳染病監(jiān)測(cè)過(guò)程中需要進(jìn)一步加強(qiáng)采樣相關(guān)知識(shí)及技能的培訓(xùn),保證檢測(cè)樣本的質(zhì)量。Sun Y研究表明提取H7N9禽流感病毒核酸時(shí),HA與NA核酸拷貝數(shù)有差異,導(dǎo)致real-time PCR檢測(cè)過(guò)程中HA的檢出率要高于NA的檢出率;本研究中患者B咽拭子樣本中檢出H7亞型,N9亞型未檢出,這與Sun Y研究相符[15];結(jié)合實(shí)際工作,后期不明原因肺炎監(jiān)測(cè)中可考慮先對(duì)敏感性較高的HA基因進(jìn)行檢測(cè),提高H7N9的檢出率。本研究表明隨著人員貿(mào)易的往來(lái),新發(fā)傳染病不再局限于某一區(qū)域,隨時(shí)都存在輸入性的風(fēng)險(xiǎn),需要提高警惕并加強(qiáng)監(jiān)測(cè),做到及時(shí)、準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)并控制傳染病。

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        R373.1+3,Q523

        A

        1674-1129(2017)05-0786-03

        10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.054

        2017-08-01;

        2017-09-13)

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