李浩然，董亞萍，楊 柳，胡 鯤，楊先樂

(1.國家水生動物病原庫；水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心；水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海 201306；2.上海長峰房地產(chǎn)開發(fā)有限公司，上海 200042)

亞甲基藍對黃顙魚魚卵高卵殼裂解酶(HCE)表達的影響

李浩然1,2，董亞萍1，楊 柳1，胡 鯤1，楊先樂1

(1.國家水生動物病原庫；水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心；水產(chǎn)科學(xué)國家級
實驗教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海 201306；2.上海長峰房地產(chǎn)開發(fā)有限公司，上海 200042)

魚卵高卵殼裂解酶(HCE)是魚類孵化酶中的一種，在水生生物胚胎發(fā)育過程中起非常重要的作用，其表達可能會受到化學(xué)藥物的影響。以黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)受精卵為研究對象，采用免疫組織化學(xué)方法研究了亞甲基藍對黃顙魚魚卵高卵殼裂解酶表達的影響。以15 mg/L亞甲基藍浸泡黃顙魚受精卵，同時設(shè)置不做任何藥物處理的空白對照組，分別在受精后0、1、2、4、8、12、24 h取黃顙魚受精卵或胚胎，4%多聚甲醛固定，石蠟切片，免疫組織化學(xué)方法染色，倒置顯微鏡觀察，Image-Pro Plus6.0軟件分析每張照片的累積光密度值。結(jié)果表明，亞甲基藍實驗組與空白對照組中均有HCE表達，但是亞甲基藍實驗組中HCE的相對表達量顯著高于其相應(yīng)的空白對照組。不同受精時間的對照組和實驗組之間HCE的相對表達量無統(tǒng)計學(xué)差異。亞甲基藍明顯促進HCE的分泌，可能與魚卵的代償或應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，由此推測亞甲基藍對胚胎有一定的毒性。

亞甲基藍；黃顙魚胚胎；魚卵高卵殼裂解酶；免疫組織化學(xué)

Abstract：High choriolytic enzyme(HCE) plays an important role during the fish artificial propagation,which could be affected by chemical drugs.In this study,the embryo ofPelteobagrusfulvidracowas chosen to measure the effect of methylene blue on expressions of HCE by using immunohistochemical method.The zygotes ofP.fulvidracowas steeped with 15 mg/L methylene blue,meanwhile the blank control group was steeped with no drug conduct.The zygotes or embryos ofP.fulvidracowhich have fertilized 0 h,1 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h were selected,immobilized by 4% paraformaldehyde and make paraffin section.Each section was observed under the microscope after immunohistochemical staining.The integral optical density(IOD) of each photograph was analyzed by Image-Pro Plus6.0 software.The results revealed that hatching enzyme distributed both in methylene blue experimental group and blank control group.However,the relative expression of HCE in methylene blue experimental group was significantly higher than the blank control group.There was no statistics difference between the relative expression of HCE in blank control group and experimental group.The results of showed that methylene blue could significantly promote the secretion of HCE.It may be associated with the compensatory or stress response of fish embryos.So we can infer that methylene blue has toxicity to embryos.

Keywords： methylene blue;embryos ofPelteobagrusfulvidraco;high choriolytic enzyme;immunohistochemisty

孵化酶(hatching enzyme)具有特異性降解卵膜的功能，廣泛存在于家蠶[1]、海膽[2]、對蝦[3]、魚類[4,5]等動物的胚胎中。魚類的孵化酶因具有特異性降解卵殼的特性而被廣泛研究，旨在用于魚類基因轉(zhuǎn)移、核移植等相關(guān)遺傳工程[6]，由高卵殼裂解酶(High Choriolytic Enzyme,HCE)和低卵殼裂解酶(Low Choriolytic Enzyme,LCE)兩種成分組成，是由魚類的孵化腺細胞分泌而來，其中HCE先于LCE被分泌出來[7]。在HCE和LCE的共同作用下使魚類胚胎的卵膜被降解[8]。黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)隸屬于鯰形目(Siluriformes)鲿科(Bagridae)黃顙魚屬(Pelteobagrus),廣泛分布于長江、黃河、珠江、沅江及黑龍江等各水域[9-11]。是一種常見的中小型經(jīng)濟魚類,具有肉質(zhì)細嫩、肉味鮮美、營養(yǎng)豐富、無肌間刺等優(yōu)點,頗受廣大消費者歡迎,市場價格一度攀升[11]。然而黃顙魚在人工繁殖過程中水霉病頻發(fā)，給養(yǎng)殖戶帶來了難以估量的經(jīng)濟損失。亞甲基藍又名堿性湖藍、次甲基藍、美藍等，呈深綠色有光澤的顆粒狀或粉狀結(jié)晶，具堿性，其水溶液呈藍色，是一種常見的工業(yè)染料，也是印染業(yè)廢水中的主要成分之一。近年來，在孔雀石綠被禁用后，亞甲基藍常被用于防治魚卵水霉病[12]。但是有研究發(fā)現(xiàn)亞甲基藍及代謝物有致畸、致突變作用，在日本、美國等國并未允許其用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[13，14]。雖然我國尚未將亞甲基藍列為禁用藥物，但是其對于魚類潛在的安全性威脅亟待研究。本實驗從HCE的角度入手，采用免疫組織化學(xué)方法評價了亞甲基藍對高卵殼裂解酶在蛋白水平相對表達量的影響，為評估亞甲基藍在魚卵孵化過程中的潛在風(fēng)險提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃顙魚受精卵由湖南省岳陽市華容縣田家湖漁業(yè)科技有限公司惠贈，受精后立即用黃泥脫粘放入孵化桶中，室內(nèi)恒溫流水孵化，孵化溫度(25±0.5) ℃，pH 7.4左右。

1.2 主要試劑

EDTA 抗原修復(fù)液、PBS緩沖液(0.01 mol/L)、Harris蘇木素染液購自廣州晶泉生物有限公司，BSA購自Sigma公司。魚卵高卵殼裂解酶一抗由上海佑隆生物科技有限公司制備，免疫組化試劑盒DAB(二氨基聯(lián)苯胺，3，3′-diaminobenzidine)顯色劑、羊抗兔二抗購自DAKO公司。

1.2.1 魚卵高卵殼裂解酶(HCE)一抗制備方法

根據(jù)日本青鳉(Oryziaslatipes)(在蛋白質(zhì)序列上，硬骨魚以日本青鳉為代表)HCE蛋白質(zhì)序列(序列號：NP_001098293.1)設(shè)計2條多肽鏈作為免疫原，分別為LLEGDLVAPTNRNA(14)和TPYDYSSIMHYGRD(14)，多肽鏈由上海佑隆生物科技有限公司合成；將偶聯(lián)后的多肽-BSA與等體積的福氏佐劑混合乳化均勻成油包水狀態(tài)后分別皮下注射到2只新西蘭大白兔，免疫3次后，取血清經(jīng)ELISA檢測，抗血清效價不低于1∶50 000；(這里的1∶50 000是最后一次免疫后血清的效價，并非做實驗(WB等)的效價)將收集到的抗血清經(jīng)硫酸銨純化，得到高卵殼裂解酶(HCE)兔多克隆抗體。

1.3 實驗方法

1.3.1 魚卵處理

參考亞甲基藍防治魚卵水霉病的用法與用量，將受精后的黃顙魚卵立即放入15 mg/L亞甲基藍中浸泡30 min，清洗數(shù)次，無損傷轉(zhuǎn)移至清水中。同時設(shè)不做任何處理的空白對照組，試驗組和空白對照組均使用500枚魚卵。孵化條件同1.1。

1.3.2 魚卵采集與組織切片

分別在受精后0、1、2、4、8、12、24 h取實驗組及空白對照組未被水霉感染的健康黃顙魚受精卵或胚胎各50枚，用PBS緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)稍稍清洗并吸干水分后，迅速將魚卵放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h后75%酒精保存。將固定好的魚卵經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為5 μm。將包含有組織的蠟塊粘附于APES粘片劑處理的載玻片上，放在40 ℃烘箱中烘干2 h后，放在玻片盒中備用。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色

將1.3.2中烘干后的切片脫蠟，修復(fù)抗原，脫色，加入一抗(陰性對照組不加入一抗)，脫色后加入二抗，滴加顯色液，復(fù)染，脫水，透明，封片。完成免疫組織化學(xué)染色[15]。

審計作為我國現(xiàn)代化建設(shè)中很重要的一部分，對于構(gòu)建我國的和諧社會有著不可忽視的作用和意義。也是我國經(jīng)濟建設(shè)和國家改革開放的重要保障。隨著社會主義現(xiàn)代化建設(shè)的進程不斷加快，審計起到的監(jiān)督作用也越來越明顯，就時代的審計主要是通過手工檢查賬簿來實現(xiàn)的，但是在此之后，計算機技術(shù)的快速發(fā)展使得信息技術(shù)滲入到社會的各個層面，審計工作是會計核算的主要手段，是信息技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)。

1.4 光密度分析

在NIKON倒置顯微鏡下觀察切片，分別隨機挑選同一采樣時間的亞甲基藍處理組和空白對照組中的切片，在200倍視野下進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。使用Image-Pro Plus6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準，對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值(Integrated Option Density,IOD)。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對各組切片的IOD進行單因素方差分析，以P<0.01為差異極顯著，0.010.05為差異不顯著，數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean ± SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃顙魚魚卵中HCE的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

由圖1可見，黃顙魚魚卵高卵殼裂解酶(HCE)陽性顆粒在各實驗組及各時間點均有明顯分布，主要分布在卵黃顆粒和卵膜上?？瞻讓φ战M與亞甲基藍組分布位置沒有明顯區(qū)別，但是亞甲基藍實驗組染色程度較高。陰性對照組沒有觀察到陽性顆粒。

圖1 各組黃顙魚魚卵HCE的表達(免疫組化染色×200)Fig.1 Expression of HCE in egg of yellow catfish by immunohistochemisty method(×200)

a.空白對照組受精后0 h；b.陰性對照組(亞甲基藍組受精后0 h)；c1.空白對照組受精后1 h；c2.亞甲基藍組受精后1 h；d1.空白對照組

受精后2 h；d2.亞甲基藍組受精后2 h；e1.空白對照組受精后4 h；e2.亞甲基藍組受精后4 h；f1.空白對照組受精后8 h；f2.亞甲基藍組

受精后8 h；g1.空白對照組受精后12 h；g2.亞甲基藍組受精后12 h；h1.空白對照組受精后24 h；h2.亞甲基藍組受精后24 h；Y.卵黃顆粒Yolk granule；M.卵膜Embryo membrane。

2.2 黃顙魚魚卵中高卵殼裂解酶表達隨孵化時間的變化

在所有采樣的時間點，亞甲基藍實驗組中黃顙魚卵高卵殼裂解酶(HCE)的積累光密度均高于空白對照組，且差異極顯著(P<0.01)(表1),實驗組與對照組組內(nèi)各時間點變化呈波動狀態(tài)，變化不明顯(圖1)。

3 討論

在魚類人工繁殖的過程中，由于水霉病的爆發(fā)而造成的經(jīng)濟損失難以計數(shù)。自從孔雀石綠被禁用后，亞甲基藍、甲醛、食鹽、五倍子等防治魚卵水霉病的藥物均被投入生產(chǎn)應(yīng)用中，并取得了一定的效果。然而關(guān)于這些藥物對魚卵的安全性研究仍不夠完善。目前國內(nèi)外對于魚卵孵化酶的研究已有報道，主要是采用Real-Time PCR法、RACE-PCR法對河川沙塘鱧(Odontobutispotamophila)和雌核發(fā)育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)的高卵殼裂解酶(HCE)基因的部分序列進行了克隆和分析，證明了河川沙塘鱧[5]、雌核發(fā)育銀鯽[6]中有高卵殼裂解酶存在，但利用免疫組織化學(xué)方法對其他我國常見養(yǎng)殖魚類孵化酶的研究報道較少。魚卵高卵殼裂解酶的表達會受到溶氧、溫度、光照等因素的影響[16]。低濃度(10-5mol/L)的MS-222(間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽，3-Aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate)、腎上腺素以及與Ca2+共存時的二價離子載體A23187(鈣鎂混合鹽，Mixed calcium-magnesium salt)或X537A(拉沙里菌素，lasalocid)可以促進魚卵高卵殼裂解酶的分泌；而高濃度(10-2mol/L)的MS-222、箭毒塊莖堿、阿托品可以抑制魚卵高卵殼裂解酶的分泌[16]。但是對于水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的常見藥物，尤其是用于魚卵孵化過程中的藥物，對高卵殼裂解酶表達的影響尚未見報道。本實驗利用免疫組織化學(xué)方法檢測亞甲基藍對黃顙魚魚卵高卵殼裂解酶表達的影響，彌補了對魚類高卵殼裂解酶研究的不足。

表1 各實驗組魚卵高卵殼裂解酶(HCE)的累積光密度Tab.1 Integrated option density of hatching Enzyme(HCE)(Mean±SD)

注：采用成對檢驗方法統(tǒng)計各組間數(shù)據(jù)，同行字母標注不同者表示差異極顯著(P<0.01)。

圖2 各實驗組魚卵高卵殼裂解酶(HCE)的累積光密度Fig.2 Integrated option density of hatching enzyme(HCE)(Mean±SD)

亞甲基藍為印染業(yè)廢水中的典型有機物之一，但進入水體后會顯著提高水體的化學(xué)需氧量(COD)，吸收光線，降低水體透明度。且不易被自然光降解[17]。有關(guān)染料廢水降解研究常常將亞甲基藍水溶液作為研究模型[18]。我國化學(xué)品安全說明書(MSDS)中明確標明亞甲基藍對水生動物、植物有毒害作用，可能對水體環(huán)境產(chǎn)生長期不良影響，應(yīng)給予特別注意。全稱污染物致突變性檢測(AMES實驗)表明亞甲基藍有潛在的致癌作用[19]。本檢測結(jié)果表明，魚卵被亞甲基藍浸泡后，高卵殼裂解酶(HCE)累積光密度值顯著升高，表明其表達量顯著升高。具體原因尚不明確，可能是由于魚卵自身在污染物脅迫下的一種代償或應(yīng)激反應(yīng)，由此推測亞甲基藍對胚胎有一定的毒性。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖實踐中，生產(chǎn)者往往將高濃度的亞甲基藍廢水隨意地排放到周圍的水體中，對養(yǎng)殖場周邊大面積的水域及土壤都造成了嚴重的污染。盡管目前尚未有直接證據(jù)表明亞甲基藍對水生生物有致畸、致癌、致突變等毒害作用，但是水體中的亞甲基藍依然會給水環(huán)境及水生動植物帶來巨大的潛在危害。所以在印染業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，應(yīng)當(dāng)謹慎使用亞甲基藍。

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TheeffectofmethyleneblueontheexpressionsofhighchoriolyticenzymeintheembroyoofPelteobagrusfulvidraco

LI Hao-ran1,2,DONG Ya-ping1,YANG Liu1,HU Kun1,YANG Xian-le1

(1.NationPathogenCollectionCenterforAquaticAnimals;ShanghaiCollaborativeInnovationforAquaticAnimalGeneticsandBreeding;NationalDemonstrationCenterforExperimentalFisheriesScienceEducation(ShanghaiOceanUniversity),
Shanghai201306,China;2.ShanghaiSummitPropertyDevelopmentCo.Ltd,Shanghai200042,China)

2017-03-28；

2017-07-21

上海市地方高校能力提升項目(17050502100)；上海高校知識服務(wù)平臺建設(shè)項目(ZF1206)；國家科技基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)運行項目

李浩然(1990- )，男，碩士研究生，專業(yè)方向為水產(chǎn)動物醫(yī)學(xué)。E-mail:hrli@shou.edu.cn

胡 鯤。E-mail:khu@shou.edu.cn

S941.99

A

1000-6907-(2017)05-0053-05