楊 星，劉文枝，馬 杰，周 勇，范玉頂，曾令兵

(1.華中農業(yè)大學水產學院，武漢430070；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢430223)

湖北地區(qū)克氏原螯蝦白斑綜合征病毒變異區(qū)ORF14/15、ORF23/24基因序列比較分析

楊 星1,2，劉文枝2，馬 杰2，周 勇2，范玉頂2，曾令兵1,2

(1.華中農業(yè)大學水產學院，武漢430070；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢430223)

試驗擴增、克隆了在湖北地區(qū)采集的19份克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)陽性樣品的變異區(qū)ORF14/15和ORF23/24基因，通過測序比較分析了湖北各WSSV毒株與GenBank公布的標準毒株間在變異區(qū)ORF14/15及ORF23/24基因的差異性。結果顯示，19份WSSV陽性樣品中有部分樣品在變異區(qū)擴增出ORF14/15、ORF23/24基因片段，變異區(qū)基因序列分析發(fā)現，與GenBank已公布的標準毒株相比，存在大片段缺失。在變異區(qū)ORF14/15，有3個毒株擴增出1 442 bp的片段，4個毒株擴增出630 bp的片段，基于變異區(qū)ORF14/15構建的系統(tǒng)進化樹顯示，這些毒株歸屬兩個不同的分支。在變異區(qū)ORF23/24，有2個毒株擴增出大小為2 096 bp的片段，進化分析發(fā)現這2個毒株在變異區(qū)ORF23/24的遺傳距離較近。

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)；白斑綜合征病毒；ORF14/15；ORF23/24；序列分析

Abstract：White spot syndrome virus (WSSV)gene variable regions,ORF14/15 and ORF23/24,have been employed as marks in a number of molecular epidemiology,prevalence and evolution studies of WSSV.In this study,19 WSSV positive samples collected from farmedProcambarusclarkiiin Hubei were cloned and sequenced for the WSSV Gene variable regions ORF14/15 and ORF23/24 then compared with the sequence of standard WSSV strain posted in GenBank.The results showed that these 19 positive samples were amplified by PCR with specific primers of ORF14/15 and ORF23/24,respectively,and in some of the positive samples the targeted products were generated in gene variable regions ORF14/15 and ORF23/24.After sequencing and multiple alignment analysis,the results showed that there were large segment deletions in the two gene variable regions.In ORF14/15,a product of 1 442 bp in length was amplified in 3 WSSV strains,while a product of 630 bp in length were amplified in another 4 WSSV strains.These WSSV strains were clustered in two different clusters based on ORF14/15 gene phylogenetic tree analysis.In ORF23/24,a product of 2 096 bp in length was amplified in two WSSV strains,the phylogenetic tree analysis showed that these two WSSV strains have a close genetic relationship.

Keywords：Procambarusclarkii;WSSV；ORF14/15；ORF23/24；sequence analysis

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱小龍蝦，其分類地位屬于節(jié)肢動物門甲殼綱十足目螯蝦科原螯蝦屬[1]?？耸显r是我國重要的淡水特色養(yǎng)殖品種，但隨著克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，其病害問題已十分突出。白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)感染養(yǎng)殖克氏原螯蝦引起的白斑綜合征，給克氏原鰲蝦養(yǎng)殖產業(yè)造成了嚴重的經濟損失。WSSV為雙鏈DNA病毒，隸屬于線頭病毒科(Nimaviridae)白斑病毒屬(Whispovirus)[2-5]。WSSV的主要宿主為蝦、蟹等多種甲殼動物，廣泛的宿主是造成WSSV迅速傳播的重要原因[6]。

WSSV首先在中國臺灣養(yǎng)殖的對蝦中發(fā)現，并迅速傳播至整個東南亞地區(qū)；1995年美國發(fā)現WSSV，隨后中、南美洲也陸續(xù)暴發(fā)對蝦白斑綜合征；2002年，歐洲地區(qū)檢測到WSSV[6]。到目前為止，GenBank上公布了4個WSSV分離株的全基因組序列，分別是臺灣株(TW,AF440570)、中國大陸株(CN,AF332093)、泰國株(TH,AF369029)以及韓國株(Korea,JX515788)。4株WSSV全基因組序列長度差異在15kb之間，預示WSSV的基因序列中存在變異[7]。WSSV的基因組大小約300kb，編碼184個開放閱讀框，其中ORF14/15、ORF23/24為兩個主要的變異區(qū)[8]。Pradeep等[9]將ORF14/15、ORF23/24這兩個變異區(qū)列為WSSV分子流行病學、遺傳進化追溯的首選對象。Marks等[6]通過對來源于泰國、中國大陸以及中國臺灣地區(qū)的三株WSSV基因組全序列比對分析，發(fā)現這3株病毒差異性主要體現在以下5個方面：(1)大片段序列缺失區(qū)ORF23/24；(2)易于發(fā)生基因重組的變異區(qū)ORF14/15；(3)轉座酶基因序列存在與否；(4)同源重復區(qū)內重復單元數目不等；(5)單核苷酸的缺失、插入及多態(tài)性。

本研究對本實驗室保存的湖北地區(qū)的19份陽性克氏原螯蝦樣品進行WSSV檢測，克隆了WSSV變異區(qū) ORF14/15、ORF23/24基因，通過序列測定與比較，分析了湖北地區(qū)克氏原螯蝦WSSV主要變異區(qū)基因的結構差異，旨在為查明WSSV各毒株間的差異性與分子流行病學特征提供資料數據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品為本實驗室保存的自湖北省克氏原螯蝦主養(yǎng)地區(qū)采集的19份陽性樣品。表1中是各樣品的來源信息。

1.2 主要試劑和儀器

病毒DNA提取試劑盒購自美國OMEGA公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自美國Promega公司；DNA聚合酶rTaq、克隆載體PMD19-T、感受態(tài)細胞DH5α、分子標準DL1000和DL2000均購自寶生物工程(大連)有限公司；LB肉湯購自上海博微生物科技有限公司；氨芐青霉素(Amp)購自德國Sigma公司。PCR儀為德國Biometra公司產品；凝膠成像系統(tǒng)和電泳儀均為美國Bio-Rad公司產品。

表1 湖北WSSV各毒株來源信息Tab.1 Information of the WSSV strains collected in Hubei

1.3 引物設計

WSSV檢測所需的引物參照國家標準(GB/T28630.2)；變異區(qū)基因擴增所需引物參照的文獻[4，7]，引物序列由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成，引物信息如表2所示。

1.4 WSSV巢式PCR檢測

取克氏原螯蝦鰓和肝胰腺組織勻漿，按照病毒DNA提取試劑盒說明書提取DNA并于-20 ℃保存。參照國家標準GB/T28630.2套式PCR法進行WSSV檢測。25 μL反應體系：10×PCR緩沖液(無Mg2+) 2.5 μL，氯化鎂溶液(25 mmol/L) 1.5 μL，dNTP (10 mmol/L) 0.5 μL，引物F1 (10 μmol/L)和R1 (10 μmol/L)各2.5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/ μL) 0.1 μL，模板1 μL，補充滅菌雙蒸水至25 μL；PCR反應程序：94 ℃預變性4min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min、1個循環(huán)；94 ℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min，39個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保溫。取2.5 μL上述PCR產物，用引物F2 (10 μmol/L)和R2 (10 μmol/L)按上述反應體系和反應條件進行第二輪PCR擴增。

表2 WSSV檢測和基因變異區(qū)擴增的引物信息Tab.2 Primers for the WSSV detection and the amplification of WSSV gene variable regions

1.5 WSSV變異區(qū)ORF14/15和ORF23/24基因擴增

將WSSV巢式PCR檢測為陽性的樣品，用于WSSV ORF14/15和ORF23/24的擴增，25 μL PCR反應體系：10×PCR緩沖液(含Mg2+) 2.5 μL，dNTP (10 mmol/L) 2 μL，引物ORF14/15 (ORF23/24)-F (10 μmol/L)和ORF14/15 (ORF23/24)-R (10 μmol/L)各0.5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/ μL) 0.25 μL，模板1 μL，補充滅菌雙蒸水至25 μL。ORF14/15的擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，5個循環(huán)；94 ℃變性30 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保溫。ORF23/24的擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、52 ℃退火1 min、72 ℃延伸3 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保溫。

1.6 WSSV變異區(qū)ORF14/15和ORF23/24基因的克隆及序列分析

將1.5中陽性PCR產物經瓊脂糖凝膠回收純化獲得目的片段，連接pMD19-T載體，轉化DH5α感受態(tài)細胞，并在含有IPTG、X-gal、Amp的LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。挑取白色菌落接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩過夜，取上述培養(yǎng)的菌液按照1.5所述PCR方法檢測片段是否插入。PCR檢測為陽性的菌液送至武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序。用DNAstar軟件對測序結果進行序列比對分析，分別以TH-96-Ⅱ株(AY753327)和TW株(AF440570)基因序列作為參照，比較分析克氏原螯蝦WSSV 基因變異位置及大小，同時與GenBank公布的WSSV-TH、WSSV-CN、WSSV-Korea、WSSV-IN-05-I(印度株，EU327501)等毒株的ORF14/15和ORF23/24基因序列進行同源性分析，用MEGA5.1軟件Neighbor Joining法構建其系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結果與分析

2.1 WSSV巢式PCR檢測結果

圖1為克氏原螯蝦樣本巢式PCR第一輪檢測電泳圖；圖2為克氏原螯蝦樣本巢式PCR第二輪檢測電泳圖。19份樣品均檢測為陽性。

2.2 WSSV 變異區(qū)ORF14/15基因擴增與序列分析

19份WSSV陽性樣品中，有7份樣品在ORF14/15區(qū)域擴增出目的片段，結果如圖3所示。測序結果顯示，在ORF14/15區(qū)域，GA-1、HM-2、HM-3擴增片段長度為1 442 bp，而GA-2、XZ-1、SZ-1、JM-1擴增片段長度為630 bp。將這7株湖北WSSV毒株與序列較為完整的WSSV-TH-96-Ⅱ及已經公布的WSSV-TW、WSSV-CN、WSSV-TH、WSSV-Korea、WSSV-IN-05-I的序列進行比對分析，比對結果見圖4。與WSSV-TH-96-Ⅱ相比較，GA-1、HM-2、HM-3三個毒株在ORF14/15區(qū)均缺失了5 138 bp，但與公布的WSSV-TW序列一致；而GA-2、XZ-1、SZ-1、JM-1四個毒株在ORF14/15區(qū)缺失5 950 bp，但與公布的WSSV-IN-05-I的序列相似性高，僅存在幾個堿基的差別。

圖1 克氏原螯蝦樣品WSSV第一輪PCR檢測電泳圖Fig.1 Electrophoresis of the first round PCR products for detection of WSSV among P.clarkiiM:DL2000分子標準；1-19:被檢測樣品；P:陽性對照；N:陰性對照。圖2同。

圖2 克氏原螯蝦樣品WSSV第二輪PCR檢測電泳圖Fig.2 Electrophoresis of the second round PCR products for detection of WSSV among P.clarkii

圖3 WSSV ORF14/15基因變異區(qū)PCR擴增電泳圖Fig.3 Electrophoresis of WSSV ORF14/15 gene variable regions amplified by PCRM:DL2000分子標準；N:陰性對照。圖5同。

2.3 WSSV變異區(qū)ORF23/24基因擴增與序列分析

在ORF23/24區(qū)域，有2份樣品中擴增出了相同大小的片段，結果見圖5。擴增產物測序后與WSSV-TW、WSSV-CN、WSSV-TH進行比對分析，結果見圖6。序列比較發(fā)現，GA-1、HM-4在ORF23/24區(qū)擴增出的片段大小一致，均為2 096 bp，與WSSV-TW相比中間均缺失了10 970 bp，與WSSV-CN相比中間缺失了9 802 bp。

圖4 WSSV不同毒株間ORF14/15基因變異區(qū)結構比對圖Fig.4 Schematic representation of WSSV ORF14/15 gene variable regions among different strains 圖中的矩形表示變異區(qū)兩端的序列，矩形內的數字代表核苷酸的數目，引物后括號內的數字表示引物在TH-96-Ⅱ毒株上對應的位置，點狀虛線表示與TH-96-Ⅱ相比缺失的部分，兩側的實線表示引物擴增區(qū)域之外的區(qū)域。

圖5 WSSV ORF23/24基因變異區(qū)PCR擴增產物電泳圖Fig.5 Electrophoresis of WSSV ORF23/24 gene variable region amplified by PCR

2.4 WSSV變異區(qū)進化樹分析

遺傳進化樹分析發(fā)現，在ORF14/15區(qū)GA-1、HM-2、HM-3與WSSV-TH-96-Ⅱ、WSSV-CN、WSSV-TH、WSSV-TW、WSSV-Korea聚為一支，GA-2、XZ-1、SZ-1、JM-1與WSSV-IN-05-I同屬一個大分支，在進化上呈現出一定的差異，基于WSSV變異區(qū)ORF14/15構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹見圖7。而WSSV湖北分離株在ORF23/24區(qū)的基因序列保持一致，且與WSSV-CN、WSSV-TH、WSSV-TW都屬于一個分支(結果未展示)，表明它們的遺傳進化距離相近。

圖6 WSSV不同毒株間ORF23/24基因變異區(qū)結構比對圖Fig.6 Schematic representation of WSSV ORF23/24 gene variable region among different strains 圖中矩形表示變異區(qū)兩端的序列，矩形內的數字代表核苷酸的數目，TW、CN和TH毒株黑色箭頭上方數字表示各自在NCBI數據庫的對應位置，GA-1、HM-4 代表測序得到的2份湖北毒株，其黑色箭頭上方的數字參考對應TW毒株，兩側的實線表示引物擴增區(qū)域之外的區(qū)域。

圖7 WSSV ORF14/15基因變異區(qū)進化樹分析

3 討論

白斑綜合征是目前危害養(yǎng)殖蝦類最為嚴重的傳染性疾病。在已報道的蝦病毒中，白斑綜合征病毒的毒性最強，且其地域及宿主分布廣泛[10]。白斑綜合征還可因養(yǎng)殖環(huán)境的溫度、溶解氧、鹽度等的變化以及多種病原因子與病毒共同作用而使病毒的毒力增強[11-13]。Wang等[14]通過比較蝦的死亡率發(fā)現不同地區(qū)的WSSV各分離株的毒性存在一些差異，即各分離株間的差異可能影響WSSV的毒性。隨著WSSV的全基因組測序研究的完成，對該病毒的研究進入基因功能的鑒定階段[15]。遺傳進化差異是分子流行病學的重要內容，在核苷酸序列上的差異必然會造成開放性閱讀框和蛋白編碼的改變。差異序列的存在，可能會使病毒自身更適應環(huán)境，更利于自身復制并建立感染。近年的研究發(fā)現，不同WSSV毒株間存在不同程度的變異[16-18]。因此，研究WSSV不同毒株之間的核苷酸序列差異，可為WSSV的分子流行病學研究提供重要的參考依據。

WSSV的變異位點常被用于研究WSSV的分子流行病學特征，有助于認識在蝦養(yǎng)殖過程中WSSV迅速傳播和演化等問題[19]。ORF14/15和ORF23/24是WSSV基因組上兩個重要的變異區(qū)域，反映了WSSV各毒株間的遺傳進化關系和分子流行病學特征[18]。本研究對19份湖北不同地區(qū)收集的WSSV陽性樣品進行了 ORF14/15和ORF23/24基因PCR擴增，結果顯示在ORF14/15區(qū)有7份樣品能擴增出產物，且片段大小存在差異，而在ORF23/24區(qū)有2份陽性樣品能擴增出相同大小的片段。19份陽性樣品中僅有部分樣品在變異區(qū)擴增出產物，造成這種現象的原因可能是這些毒株剛好缺失引物結合位點或者在這兩個變異區(qū)缺失的片段大小大于這兩個區(qū)域的最大長度[9]。

在ORF14/15區(qū)，已報道有4株亞洲毒株，即WSSV-TW，WSSV-CN，WSSV-TH，WSSV-Korea ORF14/15片段分別缺失5 138 bp、5 132 bp、5 316 bp和5 721 bp[20]。本研究中WSSV湖北株在ORF14/15區(qū)與薛暉等[4]檢測到江蘇株的缺失情況有所差異，江蘇株擴增出了1 442 bp和384 bp，而本研究中GA-1、HM-2、HM-3片段大小為1 442 bp，與WSSV-TH-96-Ⅱ相比分別缺失了5 138 bp，這與WSSV-TW、江蘇株的缺失情況一致，而 GA-2、XZ-1、SZ-1、JM-1為630 bp，與WSSV-TH-96-Ⅱ相比分別缺失了5 950 bp，Tang等[21]針對馬達加斯加島、莫桑比克和沙特阿拉伯地區(qū)毒株的實驗中也發(fā)現序列缺失有5 950 bp，同樣的缺失情況也出現在Hoa等[22]對印度和越南南部地區(qū)毒株的調查中。結合系統(tǒng)樹進化分析，GA-1、HM-2、HM-3趨近于WSSV-TW，而GA-2、XZ-1、SZ-1、JM-1則與WSSV-IN-05-I聚為一支。這一研究結果表明，WSSV在湖北克氏原螯蝦中的分布呈現一定的空間差異，這與Marks等[6,19]評估作為白斑綜合征病毒空間傳播特征分子標記的主要變異位點的研究結果相符。

在ORF23/24區(qū)，目前已知的WSSV-TH最大的缺失序列為13 120 bp，WSSV-Korea具有中等程度的缺失，為5 654 bp，而WSSV-CN缺失最小，僅1 169 bp[20]。而本研究中WSSV湖北株在ORF23/24區(qū)，GA-1、HM-4均擴增出大小為2 096 bp的片段，與WSSV-TW、WSSV-CN相比相比分別缺失了10 970 bp，9 802 bp，屬于較大片段的缺失，且與童桂香等[7]測得的凡納濱對蝦WSSV廣西株缺失片段的大小相同，推測二者的病毒來源可能相同。GA-1、HM-4在系統(tǒng)進化樹中與WSSV-CN、WSSV-TH、WSSV-TW同屬一個大分支，親緣關系密切，未表現出明顯的空間差異，這可能與蝦的來源、環(huán)境等因素有關。而許多研究表明，WSSV在傳播和進化過程中，ORF23/24區(qū)也呈現出時空差異，且WSSV的不同毒株的基因型的穩(wěn)定性將影響病毒傳播的方式和傳播速度[6,19]。Dieu等[19]研究發(fā)現WSSV越南株在ORF23/24區(qū)，較小缺失的毒株出現在越南中部，較大缺失的毒株分布在南部和北部，存在明顯的空間差異，且缺失片段的大小隨時間推移逐步增大。Lan等[23]分析比較了兩株WSSV中ORF23/24的差異性與WSSV的毒力的關系，發(fā)現在ORF23/24區(qū)缺失的片段越多的毒株，其致病性越強。由此推測，WSSV變異區(qū)不僅存在時空差異，變異區(qū)片段的缺失與病毒的毒性可能存在很大的關系。

WSSV變異區(qū)對于深入認識蝦養(yǎng)殖過程中病毒傳播和進化具有重要意義。在中國境內，不同地區(qū)的WSSV毒株就有很大的差別，如江蘇株和廣西株，在變異區(qū)ORF14/15、ORF23/24均存在較大的差異。目前對WSSV變異區(qū)的變異機制尚不能確定，環(huán)境選擇壓力可能是其原因之一[4]。WSSV湖北分離株變異區(qū)ORF14/15、ORF23/24的研究，有助于查明WSSV毒株世系間的變異差異，同時為探明WSSV變異區(qū)的分子流行病學特征提供了數據資料。

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SequencecomparisonofWSSVORF14/15andORF23/24genevariableregionsderivedfromProcambarusclarkiiinHubei

YANG Xing1,2,LIU Wen-zhi2,MA Jie2,ZHOU Yong2,FAN Yu-ding2,ZENG Ling-bing1,2

(1.CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China；2.YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuhan430223,China)

2017-04-10；

2017-07-14

湖北省科技支撐計劃項目(2015BBA234)；農業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗開放課題(2016ZJK04)

楊 星(1993- )，女，碩士研究生，專業(yè)方向為魚類病害。E-mail:yangxingxiao0220@163.com

曾令兵。E-mail:zlb@yfi.ac.cn

S945.4

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1000-6907-(2017)05-0064-08