馮愛娟，謝汝祝，任海琪，葉茂*

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學院食品與生物技術(shù)學院，廣州 510300；2.廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心，廣州 510300）

辣泡菜中乳酸菌的篩選以及理化性質(zhì)的鑒定

馮愛娟1，2，謝汝祝1，任海琪1，葉茂1，2*

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學院食品與生物技術(shù)學院，廣州 510300；2.廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心，廣州 510300）

以辣泡菜中的乳酸菌作為研究對象，從3批不同來源的材料中篩選出11株乳酸菌，經(jīng)過對比產(chǎn)酸量，最后篩選2株產(chǎn)酸量較高的菌株。通過形態(tài)特征、菌落特征、生理生化特征等初步鑒定，結(jié)果表明2株菌均可以進行乳酸發(fā)酵，其中R菌株為Lactobacillus plantarum，HPC7菌株為Bacillus toyonensis。

乳酸菌；泡菜；篩選

作為乳酸菌發(fā)酵蔬菜制品的泡菜一直深受我國各族人民喜愛，具有開胃、降低膽固醇和抗癌等保健作用，在人們的生活中起著重要的作用。目前家庭和工廠大多采用的是自然發(fā)酵生產(chǎn)泡菜，這種方法微生物種類多，發(fā)酵周期較長，發(fā)酵過程不容易控制，同時會產(chǎn)生亞硝酸鹽，對人們的身體有害，造成了嚴重的食品安全問題，嚴重制約了泡菜的大量生產(chǎn)。本研究以市場和韓國料理門店的各種泡菜作為樣品，對其中的乳酸菌進行分離和鑒定，分析菌種的特征，為泡菜發(fā)酵產(chǎn)業(yè)積累菌種。本實驗對自然發(fā)酵泡菜中的乳酸菌進行研究，對提高蔬菜制品的營養(yǎng)價值，改善蔬菜制品的風味和延長食品的保質(zhì)期有著積極意義，為酸菜的純菌發(fā)酵和現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)［1］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

口味純正的韓國泡菜、市場泡菜。

1.1.2 培養(yǎng)基成分

蛋白胨，牛肉粉，酵母粉，K2HPO4，檸檬酸三銨，CH3COONa·3H2O，葡萄糖，吐溫80，MgSO4·7H2O，MnSO4·4H2O鹽溶液。

1.1.3 試驗試劑

乙二胺四乙酸二鈉，鈣黃綠素，甲基紅。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的富集與分離初篩

以口味純正的辣泡菜為乳酸菌分離樣品，在無菌條件下操作，稱取25 g樣品及醬汁接種于富集培養(yǎng)基（MRS液體培養(yǎng)基）中，置于35℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h。將富集培養(yǎng)液進行梯度稀釋（稀釋到10－6，取10－4～10－6進行涂布）后吸取0.1 m L于分離培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基中添加1%～3%碳酸鈣）上進行涂布分離，恒溫培養(yǎng)48 h，挑取產(chǎn)酸量較強的單菌落（以融鈣圈大小為標準），在分離培養(yǎng)基中進行劃線，篩選出單菌落保藏備用。

1.2.2 菌種保藏

將篩選好的菌株接種到MRS斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，將斜面轉(zhuǎn)移至4℃冰箱中保存。

1.2.3 菌種的復(fù)篩

將分離初篩得到的菌株接種到裝有50 m L MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃培養(yǎng)72 h。通過EDTA定鈣法［2］（取過濾后的發(fā)酵液1.0 m L，加蒸餾水50 m L，加1 mol／L NaOH溶液4.0 m L，鈣黃綠素指示劑20 mg，用0.01 mol／L EDTA·Na2溶液滴定至背光觀察黃綠色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)槌壬珵橹?，并記錄消耗的EDTA·Na2體積（m L），按下式計算乳酸含量：

式中：W為乳酸含量（g／L），V為滴定時消耗的EDTA·Na2體積（m L）。

式中：W1為發(fā)酵初的重量；W2為發(fā)酵結(jié)束后的重量；W為接種量；V為三角瓶最初裝液量。定量檢測乳酸的含量。

1.3 理化性質(zhì)的鑒定

1.3.1 產(chǎn)H 2 O2試驗

移取5 m L發(fā)酵液于試管中，向試管中滴加15%H2O2，若有氣泡產(chǎn)生為陽性反應(yīng)，若無就是陰性反應(yīng)。

1.3.2 產(chǎn)H 2 S試驗

將新鮮培養(yǎng)物接種于培養(yǎng)液后，用無菌的鑷子夾取乙酸鉛紙條（普通濾紙用50～100 g／L的乙酸鉛浸泡，置于烘箱烘干后滅菌備用）懸掛于接種管內(nèi)，下端接近培養(yǎng)液表面而不接觸液面，上端用膠塞塞緊，37℃培養(yǎng)48 h，紙條變黑為陽性反應(yīng)。

1.3.3 甲基紅試驗

從保藏的斜面上挑取1環(huán)菌株，接種于裝有滅好菌的50 m L MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，每日取培養(yǎng)液1 m L，滴加1～2滴甲基紅指示劑，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性呈黃色。直到發(fā)現(xiàn)陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果。甲基紅為酸性指示劑，p H范圍為4.4～6.0，其p K值為5.0。故在p H 5.0以下，隨酸度而增強紅色，在p H 5.0以上，則隨堿度而增強黃色，在p H 5.0或上下接近時，可能變色不夠明顯，此時應(yīng)延長培養(yǎng)時間，重復(fù)試驗［3］。

1.3.4 明膠液化試驗

從保藏的斜面中挑取1環(huán)菌株，接種于明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置30℃培養(yǎng)，以1支未接種的試管作為對照。將接種的和未接種的對照管置于冰箱中，等待對照管凝固后記錄試驗結(jié)果，反復(fù)觀察對比多次。如對照管凝固時，接種管液化為陽性反應(yīng)，凝固為陰性反應(yīng)［4］。

1.3.5 檸檬酸鹽

取幼齡菌種接種于檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基上，36℃培養(yǎng)3～7天，培養(yǎng)基呈堿性（藍色）者為陽性反應(yīng)，不變者則為陰性。

1.4 菌株的16S r DNA測序

氨氮降解菌菌株的16S r DNA PCR擴增引物采用通用引物：正向引物27F，反向引物1492R（由上海生物工程有限公司合成），擴增產(chǎn)物電泳檢測后送上海生物工程有限公司測序?qū)y得序，列通過NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站的GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫內(nèi)進行BLAST比對，找出核酸數(shù)據(jù)庫中與氨氮降解菌菌株同源性較高的菌株序列，下載這些菌株的DNA序列，然后用生物軟件MEGA4進行CLUSTAL比對并構(gòu)建氨氮降解菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離

菌株產(chǎn)酸量高低與溶鈣圈大小成正比［5］，據(jù)此共分離出11株產(chǎn)酸量較高的乳酸菌，編號為R，CP1，CP3，CP7，HPC1，HPC2，HPC3，HPC4，HPC5，HPC6，HPC7。用EDTA定鈣法測產(chǎn)酸，其實驗結(jié)果見表1，結(jié)果表明R號菌和HPC7號菌產(chǎn)酸量較大。選這2株菌進行接下來的鑒定等實驗。

表1 使用EDTA定鈣法測定菌株產(chǎn)酸量結(jié)果Table 1 The results of acid production determined by using EDTA calcium method mL

2.2 菌種鑒定

R和HPC7菌株經(jīng)革蘭氏染色后于顯微鏡下觀察，細胞完全或大部分是細桿狀，均為紫色，因此均屬于革蘭氏陽性菌，無芽孢。染色圖見圖1和圖2，試驗結(jié)果見表2。

圖1 R菌株的革蘭氏染色圖Fig.1 Gram stain of strain R

圖2 HPC7菌株的革蘭氏染色圖Fig.2 Gram stain of strain HPC7

表2 鑒定實驗結(jié)果Table 2 Results of identification experiment

2.3 菌株R和HPC7的16S r DNA測定結(jié)果

將菌株R和HPC7的16S r DNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫并構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖3 R的16S r DNA序列比對結(jié)果Fig.3 16S r DNA sequence alignment results of strain R

由圖3可知，R菌株與Lactobacillus plantarum（植物乳桿菌）的親緣性最近，序列相似度達100%，二者在系統(tǒng)發(fā)育樹上亦處于同一分支；結(jié)合該菌的理化特征可以初步鑒定HRC1菌株屬于Lactobacillus plantarum。

圖4 HPC7的16S r DNA序列比對結(jié)果Fig.4 16S r DNA sequence alignment results of strain HPC7

由圖4可知，HPC7屬于芽孢桿菌屬，與菌株Bacillus toyonensisBCT-7112T的序列相似度達100%，二者在系統(tǒng)發(fā)育樹上亦處于同一分枝，所以初步確定HPC7菌株為Bacillus toyonensis。

3 結(jié)果討論

從2批辣泡菜樣品中分離純化出11個菌株，在菌落及菌株形態(tài)上表現(xiàn)出豐富的微生物多樣性，說明不同批次的乳酸菌優(yōu)勢菌株有所不同［6］；而不同批次的乳酸菌菌株的酸性有很大差異，說明附著于不同樣品的乳酸菌菌株的酸性有很大差異。試驗結(jié)果表明：辣泡菜中含有大量的乳酸菌，產(chǎn)生了豐富的乳酸菌種類的多樣性，可為腌菜、泡菜等發(fā)酵食品微生物菌劑的篩選提供豐富的菌株資源，而且可以作為酸蘿卜、辣椒醬等食品的發(fā)酵菌株。

以產(chǎn)酸菌株平板篩選出R及HPC7菌株的融鈣圈的大小和EDTA定鈣法的結(jié)果，表明這2株菌可能是產(chǎn)酸能力較強的菌株，但還需對培養(yǎng)條件優(yōu)化選出最優(yōu)的培養(yǎng)條件來篩選出產(chǎn)酸能力強的乳酸發(fā)酵菌株。

通過一系列的理化鑒定，試驗中發(fā)現(xiàn)R號菌和HPC7號菌都具備乳酸菌的性能，可初步認定R號菌和HPC7號菌均為乳酸產(chǎn)生菌，可作為發(fā)酵食品的菌株。

［1］葛菁萍，鄒鵬，宋剛，等.酸菜發(fā)酵液中乳酸菌的分離與鑒定［J］.食品工業(yè)科技，2007，28（10）：83-84.

［2］樊永紅，王麗，柳丹，等.米根霉發(fā)酵液中乳酸含量的測定方法研究［J］.生物技術(shù)，2007，17（1）：54-55.

［3］時永杰.乳酸菌發(fā)酵辣椒醬菌種的篩選及系列辣椒醬產(chǎn)品的研發(fā)［D］.石河子：石河子大學，2013.

［4］熱娜·米吉提，烏斯?jié)M·依米提，周秀文，等.飼料乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)良菌株篩選［J］.生物技術(shù)通報，2016（6）：166-168.

［5］盛海圓.傳統(tǒng)泡菜中乳酸菌的分離鑒定及其多樣性分析［D］.合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學，2010.

［6］楊海英，張振寧，佐玉梅，等.腌菜中乳酸菌的分離及產(chǎn)酸菌篩選研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2012（13）：7909-7910.

Selection and ldentification of Physical and Chemical Properties of Lactic Acid Bacteria from Spicy Fermented Vegetables

FENG Ai-juan1，2，XIE Ru-zhu1，REN Hai-qi1，YE Mao1，2*
（1.School of Food and Biological Technology，Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，China；2.Engineering and Technology Development Center of Special Condiments in Guangdong Colleges and Universities，Guangzhou 510300，China）

The lactic acid bacteria in spicy fermented vegetables are studied，select 11 strains ofLactobacillusfrom 3 batches of different sources of materials as the object of the study.After comparing their acid production，select 2 strains of lactic acid bacteria which produce more acids.Finally，by identifying their morphological feature，colony characteristics and physiological and biochemical characteristics，etc.preliminarily，the result shows that the 2 strains can produce lactic acid and strain R isLactobacillus plantarums，while HPC7 isBacillus toyonensis.

lactic acid bacteria；fermented vegetables；selection

TS201.3

A

10.3969／j.issn.1000-9973.2017.10.031

1000-9973（2017）10-0143-04

2017－04－03 *通訊作者

廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心建設(shè)項目（GCZX-B1103）；國家青年科學基金項目（31500102）；“創(chuàng)新強效工程”之自主創(chuàng)新能力提升項目（1A10205）

馮愛娟（1976－），女，副教授，博士，研究方向：微生物發(fā)酵。