郭禮強(qiáng)，崔曉娜，丁葵英，孫朝紅，王亮亮，劉春雪

（1.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊 261041；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定芝麻醬中16種真菌毒素

郭禮強(qiáng)1*，崔曉娜2，丁葵英1，孫朝紅1，王亮亮1，劉春雪1

（1.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊 261041；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

建立了芝麻醬中16種真菌毒素（赭曲霉毒素A、T-2毒素、伏馬菌素B2、伏馬菌素B1、O-甲基雜色曲霉素、蛇形菌素、新茄鐮孢菌醇、雜色曲霉素、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、曲酸、青霉酸、橘青霉素、黃曲霉毒素M1）多殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS／MS）的檢測(cè)方法。芝麻醬樣品經(jīng)乙腈-水-乙酸（80∶19∶1，體積分?jǐn)?shù)，下同）溶液提取，QuEChERS方法凈化后，以含0.1%甲酸的水溶液與乙腈為流動(dòng)相，經(jīng)ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）分離，以多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：16種真菌毒素的檢出限為0.03～1.5μg／kg，定量限為0.10～4.0μg／kg；線性范圍在0.10～200μg／kg內(nèi)各成分的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.991；樣品在定量限1倍、2倍和10倍3個(gè)添加水平下的平均回收率為70.7%～99.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.26%～10.5%。該方法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，可用于芝麻醬中多種真菌毒素污染的監(jiān)控分析。

芝麻醬；真菌毒素；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；分散固相萃取

真菌毒素是某些真菌（霉菌）在農(nóng)作物、谷物或食品中繁殖代謝產(chǎn)生的一些次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些真菌毒素污染食品被人類(lèi)食用后會(huì)引起中毒，毒性大的甚至?xí)?dǎo)致癌癥、畸形，嚴(yán)重威脅消費(fèi)者的生命，如黃曲霉毒素B1是目前已知的化學(xué)物質(zhì)中致癌性極強(qiáng)的一種，是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍。真菌毒素的產(chǎn)生主要來(lái)自于農(nóng)作物田間、運(yùn)輸及儲(chǔ)存階段有毒真菌的侵染、繁殖和擴(kuò)散［1，2］，受環(huán)境影響因素很大，然而文獻(xiàn)已報(bào)道的300～400種真菌毒素［3］，只在少數(shù)食品或飼料中得到了監(jiān)管。已有的對(duì)真菌毒素的研究主要在小麥、玉米、花生和食用油方面，防止其進(jìn)入食物鏈，而對(duì)于調(diào)味品污染真菌毒素的檢測(cè)方法由于研究和檢測(cè)技術(shù)的不成熟而少有報(bào)道。芝麻的生長(zhǎng)周期和環(huán)境需求與花生類(lèi)似，營(yíng)養(yǎng)成分比較全面，也易污染真菌毒素。黃聲靈等［4］在湖北省32份芝麻樣品中檢出19個(gè)屬共80個(gè)種的真菌，其中就有多種產(chǎn)毒菌屬，如雜色曲霉屬、黃曲霉屬等。趙輝等［5］在我國(guó)6個(gè)芝麻主產(chǎn)區(qū)的13個(gè)廣泛栽培的芝麻品種中檢出多種產(chǎn)毒菌屬，如在芝麻種子外部和內(nèi)部均檢出鐮孢屬、曲霉屬和青霉屬等產(chǎn)毒菌屬。2016年1月份，武漢市食品藥品監(jiān)督管理局對(duì)本市芝麻醬進(jìn)行抽查檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)5%的芝麻醬中黃曲霉毒素B1超標(biāo)。若芝麻收獲期間氣候潮濕多雨或芝麻運(yùn)輸、儲(chǔ)存方式不正確，會(huì)很容易產(chǎn)生真菌毒素。由于真菌毒素一般對(duì)光、熱和酸穩(wěn)定，芝麻中的真菌毒素會(huì)殘留在產(chǎn)品芝麻醬中。

目前，真菌毒素的檢測(cè)方法主要有免疫法［6］、液相色譜法［7－9］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［10－19］。免疫法檢測(cè)速度快，儀器簡(jiǎn)單易攜帶，但一般是檢測(cè)的輔助手段，特異性和靈敏度較差。液相色譜法使用比較普遍，但選擇性較差，多種毒素同時(shí)檢測(cè)受到限制。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法選擇性好，操作簡(jiǎn)單，通量高，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種目標(biāo)分析物同時(shí)檢測(cè)。本文選取易污染芝麻醬的多種真菌毒素為研究對(duì)象，結(jié)合Qu ECh ERS前處理凈化技術(shù)，建立了16種真菌毒素的UPLC-MS／MS檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)單、方便，有很強(qiáng)的可操作性，可實(shí)現(xiàn)多種真菌毒素的同時(shí)定性定量分析，對(duì)食品企業(yè)及政府相關(guān)執(zhí)法部門(mén)提供了技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀：Waters Utra Performance LC／Qtrap 5500（美國(guó)Waters公司／美國(guó)AB公司），配電噴霧離子源（ESI）；離心機(jī)：5810R型（德國(guó)Eppendorf公司）；氮吹儀：N-EVAP型（美國(guó)Organomation Associates公司）；純水機(jī)：Milli-Q型（美國(guó)Millipore公司）；超聲波清洗器：KQ-500型（昆山市超聲儀器有限公司）。

曲酸（Kojic acid）、青霉酸（Penicillic acid）、O-甲基雜色曲霉素（O-Methylsterigmatocystin）、雜色曲霉素（Sterigmatocystin）、伏馬菌素B1（Fumonisin B1）、伏馬菌素B2（Fumonisin B2）：購(gòu)于Sigma公司；橘青霉素（Citrinin）、黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1）、黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1）、黃曲霉毒素B2（Aflatoxin B2）、黃曲霉毒素G1（Aflatoxin G1）、黃曲霉毒素G2（Aflatoxin G2）、蛇形菌素（Diacetoxyscirpenol）、新茄鐮孢菌醇（Neosolaniol）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）、T-2毒素（T-2 toxin）：均購(gòu)于Biopure公司；QuEChERS凈化包（WondaPak）：購(gòu)于日本Shimadzu公司；乙腈、乙酸乙酯、甲醇和甲酸（均為色譜純）：德國(guó)Merck公司。

用乙腈配制濃度分別為100μg／L的各真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再根據(jù)需要用芝麻醬提取液稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，在4℃下保存，有效期3個(gè)月。

1.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；柱溫：40℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸-水，流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.3 m L／min；進(jìn)樣量：10μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3 質(zhì)譜條件

大氣壓電噴霧電離源（ESI），正離子電離模式；干燥氣：10 L／min；干燥溫度：350℃；噴霧氣：50 psi；毛細(xì)管電壓：3500 V；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；16種真菌毒素的部分質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 16種真菌毒素的部分質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Some parameters of MS for 16 mycotoxins

續(xù) 表

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱(chēng)?。?±0.01）g均勻的芝麻醬樣品，置于50 mL離心管中，加入10 m L乙腈-水-乙酸（80∶19∶1，體積比，下同）溶液渦混1 min，以10000 r／min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液6 m L至10 m L潔凈玻璃試管中，加入200 mg ODS渦旋振蕩均勻，靜置5 min分層，取5 m L上清液至潔凈的10 m L玻璃試管中氮?dú)獯蹈桑? m L初始流動(dòng)相溶液溶解，渦混振蕩均勻，過(guò)0.22μm微孔濾膜后，經(jīng)UPLC-MS／MS分析測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取凈化

提取溶劑對(duì)目標(biāo)分析物的回收率有一定影響，查閱文獻(xiàn)，主要為甲醇-水和乙腈-水。對(duì)比了甲醇-水和乙腈-水2種提取溶劑對(duì)16種真菌毒素回收率的影響，數(shù)據(jù)表明使用乙腈-水作為提取溶液真菌毒素回收率好于以甲醇-水作為提取溶液，和多數(shù)文獻(xiàn)提取方法吻合。進(jìn)一步考察了提取溶液酸堿度對(duì)回收率的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)赭曲霉毒素A和蛇形菌素在堿性條件下易分解，造成回收率不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)比較了甲酸、乙酸和鹽酸3種試劑對(duì)目標(biāo)提取物回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸對(duì)赭曲霉毒素A和蛇形菌素的回收率最好，經(jīng)過(guò)梯度添加最終確定在提取溶液中加入1%乙酸。芝麻易侵染多種產(chǎn)毒真菌，而免疫親和柱和多功能凈化柱受真菌毒素種類(lèi)限制，使用成本高，且不能對(duì)多種真菌毒素同時(shí)凈化，本文引用Qu ECh ERS方法，通過(guò)基質(zhì)加標(biāo)后用QuEChERS法凈化，發(fā)現(xiàn)凈化效果很好，以赭曲霉毒素A舉例，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 芝麻醬樣品經(jīng)QuEChERS凈化前（a）和凈化后（b）赭曲霉毒素A質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of Ochratoxin A in sesame paste（a）before and（b）after QuEChERS purification

2.2 色譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相的組成和配比對(duì)目標(biāo)分析物有顯著影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在水相中加入甲酸可以顯著提高真菌毒素MRM的響應(yīng)值，同時(shí)對(duì)比了甲醇和乙腈2種有機(jī)相對(duì)目標(biāo)分析物提取離子流圖的影響，發(fā)現(xiàn)乙腈作有機(jī)相各真菌毒素有更好的響應(yīng)值，試驗(yàn)經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索確定了表1所述流動(dòng)相比例梯度和流速，應(yīng)用該方法各真菌毒素的色譜峰峰形良好。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以兩通代替色譜柱，分別將100μg／L的16種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品溶液通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器以5μL／min的流速直接注入質(zhì)譜離子源，得到各目標(biāo)分析物碎片離子信息，確定定量離子對(duì)和定性離子對(duì)，優(yōu)化各質(zhì)譜參數(shù)，16種真菌毒素優(yōu)化的MRM質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2，各真菌毒素的提取離子流圖見(jiàn)圖2。

圖2 16種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM圖Fig.2 MRM chromatograms of mixed standard solution of 16 mycotoxins

2.4 方法的線性關(guān)系和檢出限

將16種真菌毒素質(zhì)量濃度在0.03～200μg／L之間的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（用空白芝麻醬提取液配制）進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定，分別以測(cè)得的各真菌毒素化合物峰面積的平均值Y對(duì)質(zhì)量濃度X（μg／L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.991。以3倍信噪比（S／N）響應(yīng)值所對(duì)應(yīng)的濃度作為方法的檢出限（LOD），以10倍信噪比（S／N）響應(yīng)值所對(duì)應(yīng)的濃度作為方法的定量限（LOQ）。16種真菌毒素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限數(shù)據(jù)指標(biāo)見(jiàn)表3。

表3 16種真菌毒素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限（n＝6）Table 3 Linear equations，correlation coefficients，linear ranges，LODs and LOQs of 16 mycotoxins（n＝6）

2.5 方法的回收率及精密度

分別在芝麻醬基質(zhì)中添加1倍、2倍和10倍定量下限濃度的真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每種濃度做6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各種真菌毒素的回收率和精密度（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）。16種真菌毒素3個(gè)添加水平下的平均回收率為70.7%～99.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.26%～10.5%，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 16種真菌毒素的加標(biāo)回收率和精密度（n＝6）Table 4 Recoveries and RSDs of 16 mycotoxins（n＝6）

續(xù) 表

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的10份芝麻醬中的真菌毒素含量進(jìn)行了測(cè)定，從一份芝麻醬樣品中檢測(cè)到O-甲基雜色曲霉素，檢測(cè)含量為0.14μg／kg，應(yīng)引起生產(chǎn)企業(yè)和相關(guān)監(jiān)管部門(mén)的重視。

3 結(jié)論

本文建立了芝麻醬中16種真菌毒素殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定方法，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)16種真菌毒素同時(shí)定性定量分析。該方法前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，靈敏度高，實(shí)用性強(qiáng)，可以滿足對(duì)芝麻醬中多種真菌毒素殘留的檢測(cè)需求。

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Determination of 16 Mycotoxins in Sesame Paste by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GUO Li-qiang1*，CUI Xiao-na2，DING Kui-ying1，SUN Zhao-hong1，WANG Liang-liang1，LIU Chun-xue1
（1.Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weifang 261041，China；2.Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College，Weifang 261061，China）

A method is established for the determination of 16 mycotoxin residues in sesame paste，including Kojic acid，Penicillic acid，O-Methylsterigmatocystin，Sterigmatocystin，F(xiàn)umonisin B1，F(xiàn)umonisin B2，Citrinin，Aflatoxin M1，Aflatoxin B1，Aflatoxin B2，Aflatoxin G1，Aflatoxin G2，Diacetoxyscirpenol，Neosolaniol，Ochratoxin A，T-2 toxin using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS／MS）.The sesame paste is purified with Qu ECh ERS method after extraction by acetonitrile water solution（80∶19∶1）with 1%（V／V）aceticacid，and then being separated on a ACQUITY UPLC BEH C18column（2.1 mm×50 mm，1.7μm）using gradient elution with the mobile phase of water solution with 0.1%formic acid and acetonitrile.A multiple reaction monitoring（MRM）is as survey scan with external standard method.The results indicate that the limits of detection（LOD，S／N＝3）for 16 mycotoxins are 0.03～1.5μg／kg，the limits of quantification（LOQs，S／N＝10）are 0.10～4.0μg／kg.The range of 0.10～200μg／kg for 16 mycotoxins has good linear relationship（r＞0.991）.The average recoveries（n＝6）of the 16 mycotoxins in sesame paste samples at one，two and ten addition levels of LOQ range from 70.7%to 99.2%with the relative standard deviations（RSDs）between 3.26%and 10.5%.The method is convenient，sensitive and quick，which could satisfy the demands for determination of mycotoxin residues in sesame paste.

sesame paste；mycotoxin；liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS／MS）；dispersive solid-phase extraction

TS264.2

A

10.3969／j.issn.1000-9973.2017.10.034

1000-9973（2017）10-0154-06

2017－04－18 *通訊作者

濰坊市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃（2014RKX094）；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃（J16LE52）

郭禮強(qiáng)（1980－），男，山東濰坊人，工程師，碩士，研究方向：食品中農(nóng)、獸藥殘留和真菌毒素的檢測(cè)。