魏東斌，趙慧敏，杜宇國(guó),2

1. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京1000852. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049

二苯甲酮類紫外防曬劑發(fā)光菌急性毒性及QSAR研究

魏東斌1,2,*，趙慧敏1，杜宇國(guó)1,2

1. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京1000852. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049

二苯甲酮類化合物廣泛用于防曬劑、塑料添加劑、香味劑等。隨著紫外防曬產(chǎn)品的大量使用，其環(huán)境及健康風(fēng)險(xiǎn)越來越受到人們的關(guān)注。為揭示二苯甲酮類污染物的毒性特征，選擇了14種二苯甲酮類化合物作為目標(biāo)化合物，測(cè)試了它們對(duì)發(fā)光細(xì)菌的急性毒性效應(yīng)。分別運(yùn)用二維、三維定量構(gòu)效相關(guān)技術(shù)和分子對(duì)接技術(shù)探討了目標(biāo)化合物的分子結(jié)構(gòu)特征對(duì)毒性效應(yīng)的影響。結(jié)果表明14種二苯甲酮類化合物對(duì)發(fā)光菌急性毒性的EC50值在17.67到243.82 mg·L-1范圍內(nèi)，其中2-羥基-4-甲氧基-5-磺酸基二苯甲酮的急性毒性最低，2,2′,4,4′-四羥基二苯甲酮的毒性最高。羥基取代的二苯甲酮化合物的急性毒性隨著分子中羥基數(shù)量的增加而升高；具有相同羥基數(shù)量的二苯甲酮類化合物，羥基位于苯環(huán)4-位時(shí)毒性最高，3-位時(shí)次之，2-位時(shí)毒性最低。QSAR結(jié)果表明，運(yùn)用靜電場(chǎng)、氫鍵受體場(chǎng)和氫鍵供體場(chǎng)能很好解釋這類化合物的毒性特征，若在苯環(huán)4-位引入帶正電荷的官能團(tuán)、在苯環(huán)2-, 4-位引入氫鍵受體，都將導(dǎo)致毒性升高。上述研究結(jié)果將為科學(xué)評(píng)價(jià)該類化合物的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

二苯甲酮；紫外防曬劑；發(fā)光細(xì)菌；急性毒性；定量構(gòu)效相關(guān)

Received23 January 2017accepted13 March 2017

Abstract: Benzophenones (BPs) are widely used in UV filters, plastic additives, and fragrance enhancers. With the wide use of UV filters products, their potential risk to the ecological and human health has been concerned greatly. Fourteen BPs were selected as targets, and their acute toxicity was tested using the photobacterium assay. The related substituent contribution was disclosed by using 2- and 3-dimension quantitative structure-activity relationship (QSAR) and molecular docking methods. The results revealed that the EC50values of 14 BPs ranged from 17.67 to 243.82 mg·L-1, and the acute toxicity of 2-hydroxy-4-methoxy-5-sulfonic acid BP was the lowest, while that of 2,2’,4,4’-tetrahydroxy-BP was the highest. The acute toxicity increased with the increasing number of hydroxy group in BPs. For the BPs containing same number of hydroxy groups, BPs with hydroxy group at 4-position of benzene ring exhibited the highest toxicity, and lower toxicity was observed with hydroxy group at 3-position, while that at 2-position showed the lowest toxicity. Furthermore, 2- and 3- dimensional quantitative structure - activity relationships (2D- and 3D - QSAR) studies indicated that hydrogen-bond interactions and electrostatic effects were determinants for the acute toxicity of the BPs. The introduction of groups with positive charges at 4-position, or hydrogen-bond acceptor at 2-, 4-position of benzene ring, would lead to the increase of acute toxicity. The present results would provide useful information for evaluating the potential ecological and human health risk of BP-type UV-filters.

Keywords: benzophenones; UV-filters; photobacterium assay; acute toxicity; quantitative structure - activity relationship

紫外防曬劑作為添加劑已被廣泛用于個(gè)人護(hù)理用品、藥物、塑料、農(nóng)用化學(xué)品等商業(yè)產(chǎn)品中，一項(xiàng)針對(duì)市售個(gè)人護(hù)理用品的調(diào)查中共檢出26種有機(jī)紫外防曬劑[1]。紫外防曬劑進(jìn)入環(huán)境一般有2種途徑，其一是人們擦涂在身體上的防曬劑在游泳、洗浴等活動(dòng)中直接進(jìn)入環(huán)境水體，其二是生產(chǎn)和生活中使用的防曬劑經(jīng)污水處理廠間接排入環(huán)境[2]。雖然每人每天防曬劑的使用量較小，但長(zhǎng)期連續(xù)排放所帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。二苯甲酮類化合物(BPs)是一類重要的紫外防曬劑，已有大量在環(huán)境介質(zhì)、生物體中檢出的報(bào)道[3-7]。市政污水處理廠進(jìn)水和二級(jí)處理出水中2-羥基-4-甲氧基-BP和2-羥基-4-甲氧基-5-磺酸基-BP的濃度范圍分別是1.5～19 μg·L-1和0.01～2.7 μg·L-1[8-12]。瑞士Glatt River河水中2-羥基-4-甲氧基-BP的累積濃度達(dá)到42 ng·L-1[6]。Wang等[13]研究了美國(guó)、韓國(guó)、日本、中國(guó)室內(nèi)灰塵中2-羥基-4-甲氧基-BP、4-羥基-BP、2,4-二羥基-BP、2,2’-二羥基-4-甲氧基-BP和2,2’,4,4’-四羥基-BP的含量，5種防曬劑總含量的中位值范圍為78.3～612 ng·g-1。美國(guó)女性尿液中2-羥基-4-甲氧基-BP的含量為0.28～5 900 μg·L-1，2,4-二羥基-BP的含量為0.082～3 200 μg·L-1，4-羥基-BP的含量為0.082～22 μg·L-1[14]。

盡管個(gè)人護(hù)理用品在上市前開展過相關(guān)的毒理學(xué)研究，但使用過程中也有部分報(bào)道顯示擦涂在皮膚上的二苯甲酮類化合物可能引起光致過敏[15]和細(xì)胞毒性[16]，只是毒性效應(yīng)并不十分顯著[17-19]。然而，隨著近年來毒理學(xué)研究的不斷深入，越來越多的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)表明BPs類化合物對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)有明顯的干擾效應(yīng)[20-23]和發(fā)育毒性[24]。流行病學(xué)調(diào)查顯示男性暴露于2,2’,4,4’-四羥基-BP、4-羥基-BP等可導(dǎo)致夫妻生育能力分別下降31%和26%[25]。部分BPs類化合物已被列入“懷疑具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的物質(zhì)”[26]。除了內(nèi)分泌干擾效應(yīng)外，近年來也有研究者對(duì)該類化合物的遺傳毒性和急性毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，比如Zhao等[27]運(yùn)用SOS/umu檢測(cè)了14種BPs類化合物的遺傳毒性，發(fā)現(xiàn)引起陽(yáng)性效應(yīng)的最低濃度范圍為81.97～>1 000 mg·L-1。SOS/umu和Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2,4-二羥基-BP在10 μg·mL-1暴露劑量下即顯示出活性[28]。2-羥基-4-甲氧基-BP和2-羥基-4-甲氧基-5-磺酸基-BP對(duì)大型蚤暴露的48 h-LC50分別為1.9和50 mg·L-1[12]。2-羥基-4-甲氧基-BP對(duì)鏈帶藻的72 h-IC10為0.56 mg·L-1[29]。Liu等[30]比較了系列BPs類化合物對(duì)大型蚤和其他水生生物的急性毒性，發(fā)現(xiàn)大型蚤作為受試生物更為敏感。

細(xì)菌在生態(tài)系統(tǒng)中扮演非常重要的角色，因此通過研究污染物對(duì)細(xì)菌的毒性效應(yīng)對(duì)評(píng)價(jià)污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義?；诎l(fā)光細(xì)菌的急性毒性測(cè)試方法因具有簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好、與其他毒性測(cè)試方法所得結(jié)果相關(guān)性高等諸多優(yōu)點(diǎn)，被國(guó)內(nèi)外研究者廣泛接受[31-32]。由于環(huán)境中化學(xué)污染物的種類繁多、毒性差異顯著，若對(duì)所有污染物一一進(jìn)行各種毒性效應(yīng)的檢測(cè)是不可能的。定量構(gòu)效相關(guān)技術(shù)(QSAR)通過對(duì)部分化合物已有的毒性數(shù)據(jù)與其分子結(jié)構(gòu)描述符進(jìn)行統(tǒng)計(jì)建模的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)對(duì)其他結(jié)構(gòu)類似化合物毒性的科學(xué)預(yù)測(cè)，為環(huán)境中化學(xué)污染物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和管理提供了可能，也為揭示污染物的致毒機(jī)理提供參考[30,33-35]。

因此，從BPs類防曬劑的分子結(jié)構(gòu)出發(fā)，選擇了14種具有代表性的化合物為研究對(duì)象，測(cè)定了它們對(duì)發(fā)光細(xì)菌的急性毒性效應(yīng)。由于這些化合物都有共同的BP分子骨架，區(qū)別在于取代基的類型、位置和數(shù)量不同，因此，各化合物的毒性差異主要取決于母體骨架上取代基的不同。在定性分析各化合物毒性差異的基礎(chǔ)上，運(yùn)用二維、三維定量構(gòu)效相關(guān)方法對(duì)其毒性進(jìn)行模擬預(yù)測(cè)，同時(shí)運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)探討其毒性作用機(jī)制，為該類污染物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與儀器

14種BPs類紫外防曬劑(表1)、Na2HPO4·12H2O(純度99%)、NaH2PO4·2H2O(純度99%)、NaCl(純度99%)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；胰蛋白胨、酵母浸膏購(gòu)自BD公司；二甲亞砜(DMSO, 純度99.9%)購(gòu)自Amresco公司。實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：Milli-Q型超純水儀(Millipore，美國(guó))、Synergy2型多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek，美國(guó))、HPS-400型生化培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián))、LDZX-50FBS型高壓滅菌鍋(上海申安)、SW-CJ-1D型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)、MB100-2A型酶標(biāo)板振蕩培養(yǎng)器(杭州奧盛)、移液器(Eppendorff，德國(guó))。

1.2 發(fā)光細(xì)菌急性毒性測(cè)試

發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試方法參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法并有所改進(jìn)[30]。實(shí)驗(yàn)用菌株明亮發(fā)光桿菌T3小種(Photobacterium phosphorem T3)凍干粉由中國(guó)科學(xué)院南京土壤所提供，加入0.5 mL已滅菌的2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl溶液復(fù)蘇，取0.1 mL復(fù)蘇菌液加入20 mL濃度為3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaCl溶液中作為實(shí)驗(yàn)用菌液，21 ℃持續(xù)攪拌。將BPs母液用3%的NaCl溶液稀釋配制一系列不同濃度的工作液，進(jìn)行毒性測(cè)試。取180 μL樣品溶液(或3% NaCl溶液)加入96孔板中，加入20 μL實(shí)驗(yàn)菌液，在96孔板恒溫培養(yǎng)箱(21 ℃)中震蕩15 min，酶標(biāo)儀測(cè)試各孔的發(fā)光強(qiáng)度。樣品組的發(fā)光強(qiáng)度記為L(zhǎng)sample，空白對(duì)照組的發(fā)光強(qiáng)度記為L(zhǎng)blank，每個(gè)樣品測(cè)定3次。發(fā)光抑制率IR (%) = (1- Lsample/Lblank) ×100%。分別以樣品濃度和相對(duì)發(fā)光抑制率為橫、縱坐標(biāo)繪制半對(duì)數(shù)曲線，擬合求得相對(duì)抑制率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度值，即為待測(cè)物的EC50值。SPSS軟件(Ver.12.0)用于毒性數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 QSAR方法

用ADRIANA.Code (Ver2.2.4)軟件計(jì)算受試化合物的分子結(jié)構(gòu)參數(shù)，共獲得29種分子描述符、8種形狀描述符和88種2D加權(quán)自相關(guān)拓?fù)涿枋龇?。以描述符為自變量、pEC50為因變量，用逐步多元回歸法建立定量構(gòu)效相關(guān)方程。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用Sybyl 7.0軟件的比較分子相似指數(shù)分析(CoMSIA)法進(jìn)行三維構(gòu)效關(guān)系研究。原子電荷用Gasteiger-Huckel方法計(jì)算，能量最小化使用鮑威爾共軛梯度算法。CoMSIA是由Sybyl中的QSAR可選操作實(shí)現(xiàn)，在不作特殊聲明的情況下，其參數(shù)均用缺省值。在網(wǎng)格結(jié)點(diǎn)上以帶一個(gè)單位正電荷的sp3雜化碳原子為探針，每隔0.2 nm設(shè)一個(gè)測(cè)定點(diǎn)，用Tripos力場(chǎng)計(jì)算探針原子與化合物的相互作用能，空間場(chǎng)能和靜電場(chǎng)能閾值為30 kcal·mol-1。將14種BPs類化合物的急性毒性(pEC50)和CoMSIA值進(jìn)行偏最小二乘(PLS)分析。以δ(2 kcal·mo1-1)作為列過濾閾值。交叉驗(yàn)證得出最佳組分?jǐn)?shù)和相關(guān)系數(shù)，根據(jù)最佳組分?jǐn)?shù)進(jìn)行非交叉驗(yàn)證，建立CoMSIA模型。

1.4 分子對(duì)接Autodock方法

用Autodock 4.0軟件將BPs分子與受體分子進(jìn)行對(duì)接，按照幾何互補(bǔ)、能量互補(bǔ)、化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)等原則實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)配體與受體間的相互作用，識(shí)別2個(gè)分子間最佳結(jié)合模式。本研究采用半柔性對(duì)接方法，允許配體構(gòu)象在一定范圍內(nèi)變化。對(duì)接受體格點(diǎn)大小為40點(diǎn)×40點(diǎn)×40點(diǎn)，格點(diǎn)間距0.375 ?。計(jì)算中以半經(jīng)驗(yàn)勢(shì)函數(shù)為能量打分函數(shù)，對(duì)小分子構(gòu)象和位置進(jìn)行全域搜索，其他參數(shù)為默認(rèn)值。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

14種BPs類防曬劑對(duì)發(fā)光菌的急性毒性測(cè)試結(jié)果列于表1，15 min EC50值范圍在17.67到243.82 mg·L-1之間。在這些化合物中，13# (2-羥基-4-甲氧基-5-磺酸基-BP)對(duì)發(fā)光菌的急性毒性最低，EC50值為243.82 mg·L-1，10# (2,2′,4,4′-四羥基-BP)的毒性最高，EC50值為17.67 mg·L-1。由于所有受試化合物都包含相同的骨架結(jié)構(gòu)，其毒性差異主要取決于苯環(huán)上取代基位置和數(shù)量的變化。因此，可以通過研究取代基類型、位置和數(shù)量對(duì)毒性的影響以揭示其致毒機(jī)制。

2.學(xué)習(xí)交互。目前有許多干部網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)平臺(tái)開設(shè)了學(xué)員論壇，但是交互模塊中學(xué)員之間的交流實(shí)效性較差，難以及時(shí)地解決問題，實(shí)現(xiàn)思維的碰撞，且個(gè)人的知識(shí)點(diǎn)多散落于論壇各版塊，難以形成知識(shí)的匯聚和共享。此外，對(duì)于學(xué)員發(fā)表內(nèi)容的監(jiān)控也有一定難度。

2.1 取代基對(duì)毒性的影響

在所選擇的14種受試化合物中，大多數(shù)分子僅含有羥基官能團(tuán)，因此選擇1#到10#化合物探討羥基數(shù)量對(duì)毒性的影響。從圖1a可見，BPs類化合物的急性毒性隨苯環(huán)上羥基數(shù)量的增多而升高。1#化合物無羥基，EC50值為67.09 mg·L-1，在10種BP類化合物中毒性最低；10#化合物有4個(gè)羥基，EC50值為17.67 mg·L-1，毒性最高。含有一個(gè)羥基的2#、3#和4#，2個(gè)羥基的5#、6#和7#，3個(gè)羥基的8#和10#都比不含羥基的1#毒性高。毒性從高到低遵循以下趨勢(shì)：4個(gè)羥基 > 3個(gè)羥基 > 2個(gè)羥基 > 1個(gè)羥基 > 沒有羥基。這一趨勢(shì)與其umu遺傳毒性規(guī)律一致[27,30]。

表1 14種二苯甲酮類(BPs)紫外防曬劑結(jié)構(gòu)及其對(duì)發(fā)光菌的急性毒性EC50值Table 1 The 14 tested benzophenone (BPs) compounds and their acute toxicity EC50 values for Photobacterium phosphorem T3

除羥基數(shù)量之外，羥基在苯環(huán)上的位置對(duì)毒性也有影響。例如，2#、3#、4#化合物中僅有一個(gè)羥基，分別位于苯環(huán)的2-、3-、4-位，其毒性順序?yàn)椋?- < 3- < 4-位羥基。與此類似，含有2個(gè)羥基的化合物2,2′-二羥基-BP (5#)和4,4′-二羥基-BP (6#)，羥基在苯環(huán)4-位的6#化合物毒性大于羥基在苯環(huán)2-位的5#。這與SOS/umu遺傳毒性的規(guī)律相一致。此外，含有相同羥基數(shù)的化合物，羥基分布在2個(gè)苯環(huán)上的化合物比羥基分布在同一個(gè)苯環(huán)的毒性小。例如，2,3,4-三羥基-BP (9#)的毒性高于2,4,4′-三羥基-BP (8#)；2,4-二羥基-BP (7#)比2,2′-二羥基-BP (5#)和4,4′-二羥基-BP (6#)有更高的毒性。這與該類化合物的SOS/umu遺傳毒性、內(nèi)分泌干擾活性結(jié)果相似[21,27]。

受試化合物分子中除羥基外，其他基團(tuán)如甲氧基、辛氧基和磺酸基也對(duì)毒性有一定影響。比如5#和13#，苯環(huán)上4-位引入甲氧基降低了其毒性效應(yīng)。再如7#、11#和12#，若羥基被甲氧基和辛氧基取代，毒性也明顯降低。若8#分子中的羥基被甲氧基取代即為14#，其毒性降低。此外，在11#分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上引入磺酸基即為13#，毒性亦顯著降低，可能是因?yàn)榛撬峄囊朐黾恿嘶衔镉H水性，減少了其進(jìn)入微生物細(xì)胞的量，導(dǎo)致毒性降低。若羥基被烷氧基取代，有可能減弱了原本BPs分子中的羥基與生物大分子之間的氫鍵作用，導(dǎo)致毒性降低。辛氧基的引入大大增加了分子體積，難以進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)。這一結(jié)果與其對(duì)大型蚤、日本三角渦蟲急性毒性，以及SOS/umu遺傳毒性，雌激素受體活性等結(jié)果相似[21,27,30,36]。

2.2 2D-QSAR研究

用于多元線性回歸分析方法，建立了14種BP類化合物的發(fā)光細(xì)菌急性毒性pEC50與其分子結(jié)構(gòu)描述符之間的定量構(gòu)效相關(guān)模型：

pEC50= 0.892CA - 7.281HLC - 53.328

從方程式可以看出，BPs類紫外防曬劑的發(fā)光菌急性毒性與溶劑可接觸表面積呈正相關(guān)，與亨利常數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。這2個(gè)參數(shù)均與化合物分子的疏水性相關(guān)，溶劑可接觸分子表面積越大，化合物的疏水性越強(qiáng)；化合物的亨利常數(shù)越低，其疏水性越強(qiáng)，對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性也越強(qiáng)。雖然2D-QSAR模型能夠較好地?cái)M合14種化合物的急性毒性，但在模型驗(yàn)證過程中發(fā)現(xiàn)其對(duì)其他結(jié)構(gòu)類似化合物的毒性預(yù)測(cè)結(jié)果有較大出入。此外，通過統(tǒng)計(jì)分析方法自動(dòng)入選的2個(gè)參數(shù)雖然有一定的理化意義，但仍難以揭示化合物的真正致毒機(jī)制。因此，有必要對(duì)BPs類化合物的毒性進(jìn)行3D-QSAR研究。

2.3 3D-QSAR研究

運(yùn)用CoMSIA分析方法，以8#化合物為模板進(jìn)行分子疊合，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析建立了BPs類紫外防曬劑對(duì)發(fā)光菌急性毒性(pEC50)與分子場(chǎng)信息的3D-QSAR模型。CoMSIA模型的統(tǒng)計(jì)參數(shù)(CoMSIA-1)如表2所示，立體場(chǎng)、靜電場(chǎng)、氫鍵受體場(chǎng)、氫鍵供體場(chǎng)和疏水場(chǎng)的貢獻(xiàn)比例分別為6.8%、23.9%、15.5%、43.8%和10.0%。由于立體場(chǎng)和疏水場(chǎng)在5個(gè)場(chǎng)中所占的比例最小，因此忽略立體場(chǎng)和疏水場(chǎng)后，基于靜電場(chǎng)、氫鍵供體場(chǎng)、氫鍵受體場(chǎng)重新構(gòu)建了CoMSIA模型(CoMSIA-2)。靜電場(chǎng)、氫鍵受體場(chǎng)和氫鍵供體場(chǎng)的貢獻(xiàn)比例分別為31.0%、18.1%、50.9%。在3D-QSAR模型的3個(gè)場(chǎng)中，氫鍵供體場(chǎng)所占的比例是最大的，與CoMSIA-1模型相比，CoMSIA-2模型各參數(shù)都得到優(yōu)化，Q2由0.666增至0.737。

圖1 取代基對(duì)BPs毒性的影響注：(a) 羥基數(shù)量對(duì)毒性的影響，(b) 烷氧基對(duì)毒性的影響。Fig. 1 The effects of substituents on acute toxicity of BPsNote: (a) effect of hydroxy numbers, (b) effects of alkoxy groups.

圖2 CoMSIA模型色塊圖注：(a)靜電場(chǎng)，(b)氫鍵供體場(chǎng)，(c)氫鍵受體場(chǎng)。Fig. 2 Contour maps of CoMSIA modelsNote: (a) electrostatic field, (b) hydrogen-bond donor field, (c) hydrogen-bond acceptor field.

圖3 BPs類化合物與熒光酶蛋白的分子對(duì)接模型Fig. 3 View of docked conformation including benzophenones and luciferase proteins

CoMSIA-2中靜電場(chǎng)、氫鍵受體場(chǎng)和氫鍵供體場(chǎng)的色塊圖如圖2所示。通過分析色塊圖的顏色、大小及覆蓋區(qū)域，揭示取代基位置和性質(zhì)對(duì)BPs類化合物發(fā)光菌急性毒性的影響。對(duì)于靜電場(chǎng)而言(圖2a)，紅色塊和藍(lán)色塊的貢獻(xiàn)比例為80%和20%。紅色塊表示此處引入帶負(fù)電官能團(tuán)毒性升高，藍(lán)色塊表示此處引入帶正電的官能團(tuán)毒性升高。苯環(huán)4-位被藍(lán)色塊覆蓋，提示在苯環(huán)4-位上引入帶正荷的電官能團(tuán)將增加發(fā)光菌急性毒性。此外，有紅色塊覆蓋在苯環(huán)附近，提示在苯環(huán)上引入供電子官能團(tuán)可增加苯環(huán)上電子云密度，化合物的毒性也將增加。圖2b和2c顯示了氫鍵供體場(chǎng)和受體場(chǎng)的色塊圖。由于供體場(chǎng)和受體場(chǎng)所提示的信息是一致的，這里僅以氫鍵受體場(chǎng)(圖2c)為例進(jìn)行解釋。紫紅色塊表示增加氫鍵受體毒性增強(qiáng)，紅色表示增加氫鍵受體毒性減弱。從圖6c看出，有紫紅色塊圍繞在苯環(huán)4-位，表示在該位置增加氫鍵受體將會(huì)增加發(fā)光菌毒性。比較化合物2#和10#、11#、12#，若在苯環(huán)的4-位引入含氧的羥基、甲氧基和辛氧基等氫鍵受體，其毒性顯著增強(qiáng)。由于所引入的3個(gè)氫鍵受體強(qiáng)弱順序?yàn)椋毫u基>甲氧基>辛氧基，該順序與化合物毒性降低順序一致。3塊紅色塊分布在苯環(huán)2-位、3-位和6-位，提示在這些位置引入氫鍵受體將降低發(fā)光菌急性毒性?？赡苡捎谶@些位置上氫鍵供體的引入，增加了形成分子內(nèi)氫鍵的可能性，降低了化合物與生物分子的相互作用，毒性降低。這與Liu等[30]針對(duì)BPs類化合物對(duì)大型蚤急性毒性的3D-QSAR結(jié)果相似。

2.4 分子對(duì)接研究

明亮發(fā)光桿菌T3小種(Photobacterium phosphorem T3)的發(fā)光機(jī)理是由還原態(tài)黃素單核苷酸(FMNH2)及長(zhǎng)鏈脂肪醛在分子氧作用和胞內(nèi)熒光酶催化下氧化為黃素單核苷酸(FMN)及長(zhǎng)鏈脂肪酸，釋放出波長(zhǎng)為450～490 nm藍(lán)綠光的過程。熒光素是導(dǎo)致生物體內(nèi)催化或脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶，是發(fā)光細(xì)菌發(fā)光的重要物質(zhì)。熒光素酶是含有α、β兩個(gè)多肽亞基的單加氧酶，只有α、β兩個(gè)多肽亞基共存時(shí)才有活性。因此，本文采用計(jì)算機(jī)模擬熒光素酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，與BPs類化合物進(jìn)行分子對(duì)接，以探討該類化合物的可能致毒機(jī)制。

表3 BPs類化合物與熒光酶蛋白α-和β-亞基結(jié)合的吉普斯自由能(-dG)Table 3 The Gibbs free energy of benzophenones binding to α-subunit and β-subunit of luciferase proteins

表2 CoMSIA模型參數(shù)Table 2 Summary of CoMSIA models’ parameters

經(jīng)Autodock 4.0軟件計(jì)算，分別得到BPs類化合物與熒光素蛋白酶α、β兩個(gè)多肽亞基的結(jié)合圖(如圖3)。由圖可知，無論是α還是β亞基，所有分子幾乎都結(jié)合在同一個(gè)位點(diǎn)上。對(duì)α亞基而言，與最多分子結(jié)合的蛋白氨基酸序列是TYR245，其次是ASP286；對(duì)β亞基而言，與最多分子結(jié)合的蛋白氨基酸序列是ASN9，其次是AVL15。事實(shí)上，在與BPs結(jié)合最多的2個(gè)氨基酸殘基色氨酸、天冬酰胺中含有羥基、酰胺基等，這些官能團(tuán)容易與BPs化合物的官能團(tuán)結(jié)合形成氫鍵，增強(qiáng)了化合物的毒性效應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，計(jì)算了BPs類化合物分別與熒光酶蛋白α和β亞基結(jié)合的吉普斯自由能(-dG)(列于表3)，反映其與BPs類化合物的結(jié)合情況。-dG越小，表明蛋白質(zhì)與化合物分子結(jié)合越緊密，化合物毒性越顯著。例如，毒性最低的13#化合物，其所對(duì)應(yīng)的α和β亞基吉普斯自由能(-dG)分別為-6.06和-6.24，是所有化合物中-dG的最大值；毒性最強(qiáng)的10#化合物，其所對(duì)應(yīng)的α和β亞基吉普斯自由能(-dG)分別是-7.25和-7.61，是所有化合物中-dG的最小值。

綜上所述，通過對(duì)14種BPs類紫外防曬劑的發(fā)光菌急性毒性檢測(cè)和定量構(gòu)效相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)該類化合物具有一定的急性毒性效應(yīng)，15 min EC50值在幾十至幾百mg·L-1水平，長(zhǎng)期排放可能導(dǎo)致潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。苯環(huán)上羥基取代基的數(shù)量越多，其毒性越高；羥基位于苯環(huán)4-位時(shí)毒性最高，位于苯環(huán)3-位時(shí)毒性次之，位于苯環(huán)2-位時(shí)毒性最低；若將羥基替換為烷氧基等取代基，毒性顯著降低。定量構(gòu)效相關(guān)模型結(jié)果表明氫鍵供體場(chǎng)對(duì)毒性的貢獻(xiàn)最大，貢獻(xiàn)比例約占50%。在苯環(huán)4-位上引入帶正電荷的官能團(tuán)將增加毒性，在苯環(huán)2-，4-位上引入氫鍵受體將顯著增加急性毒性。分子對(duì)接結(jié)果顯示，BPs類化合物容易分別與發(fā)光細(xì)菌熒光酶蛋白的α亞基和β亞基中的色氨酸、天冬酰胺殘基通過氫鍵結(jié)合，增強(qiáng)了化合物的毒性效應(yīng)。本研究的結(jié)果為科學(xué)評(píng)價(jià)該類污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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◆

AcuteToxicityandQSARStudiesonBenzophenone-typeUV-filterstoPhotobacterium

Wei Dongbin1,2,*, Zhao Huimin1, Du Yuguo1,2

1. State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170123001

2017-01-23錄用日期2017-03-13

1673-5897(2017)3-234-09

X171.5

A

魏東斌(1972-)，男，環(huán)境科學(xué)博士，研究員，主要研究方向?yàn)橛袡C(jī)污染化學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文100余篇。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21377143, 21577154, 21590814)

魏東斌(1972-)，男，研究員，研究方向?yàn)橛袡C(jī)污染化學(xué)，E-mail: weidb@rcees.ac.cn；

魏東斌, 趙慧敏, 杜宇國(guó). 二苯甲酮類紫外防曬劑發(fā)光菌急性毒性及QSAR研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017, 12(3): 234-242

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