蔡富才，趙歡，李艷楠，張文龍，楊大佐，周一兵

大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023

雙齒圍沙蠶對(duì)芘的生物可利用性研究

蔡富才，趙歡，李艷楠，張文龍，楊大佐，周一兵*

大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023

為近海岸沉積質(zhì)中PAHs的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)及其污染生境的修復(fù)提供理論依據(jù)，以雙齒圍沙蠶為研究對(duì)象，以芘為暴露污染物，開展雙齒圍沙蠶對(duì)芘的生物可利用性研究，分別考察了芘對(duì)雙齒圍沙蠶抗氧化酶活性的影響以及芘在雙齒圍沙蠶體內(nèi)的生物富集特征。結(jié)果表明，雙齒圍沙蠶SOD、CAT和GSH-PX活性均隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而升高，且SOD活性隨芘濃度的增加出現(xiàn)顯著性抑制，CAT和GSH-PX活性則隨芘濃度的增加出現(xiàn)顯著性升高。芘在雙齒圍沙蠶體內(nèi)的生物富集特征如下：雙齒圍沙蠶體內(nèi)芘的蓄積量隨暴露濃度的增加而增加，各處理組雙齒圍沙蠶體內(nèi)芘的蓄積量隨時(shí)間的變化均呈類凸形的二次曲線關(guān)系，在第10天達(dá)到蓄積的最大值，最大蓄積量依次為(6.18±0.62) mg·kg-1、(12.37±1.23) mg·kg-1和(24.76±1.51) mg·kg-1。生物富集系數(shù)BCF隨芘濃度的增加而減小，分別為0.0692、0.0684和0.0674。上述研究結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，雙齒圍沙蠶抗氧化酶活性對(duì)芘的暴露具有很好的指示作用；此外，在短期內(nèi)，雙齒圍沙蠶對(duì)芘具有明顯的富集效應(yīng)。

芘；雙齒圍沙蠶；生物可利用性；抗氧化酶；生物富集

Received14 January 2017accepted13 March 2017

Abstract: In this article, the bioavailablility of pyrene in Perinereis aibuhitensis was studied. The antioxidant enzyme activities and the characteristics of bioconcentration of pyrene in P. aibuhitensis were detected. The results showed that the activities of SOD, CAT and GSH-PX in P. aibuhitensis were significantly up-regulated with prolonged exposure to pyrene. The activity of SOD was significantly decreased with increased concentration of pyrene, in contrast, the activities of CAT and GSH-PX were increased. The characteristics of bioconcentration of pyrene in P. aibuhitensis were as follows: the accumulation amount of pyrene in P. aibuhitensis showed a quadratic curve pattern with exposure time, which was increased with increased concentration of pyrene. At the 10thday of exposure to pyrene, the accumulation amount in each treatment group reached the maximum with (6.18±0.62) mg·kg-1, (12.37±1.23) mg·kg-1and (24.76±1.51) mg·kg-1, respectively. The BCFs in each treatment group was 0.0692, 0.0684 and 0.0674, respectively, which showed negative relationship with pollutant concentration. These results indicated that the activity of antioxidant enzymes in P. aibuhitensis may act as a good indicator for pyrene exposure in a certain concentration range, and furthermore, P. aibuhitensis has the ability to bioaccumulate pyrene. This article will support the further study on ecological risk evaluation and environmental remediation in the coastal sediment polluted by PAHs.

Keywords: pyrene;Perinereis aibuhitensis; bioavailablility; antioxidant enzyme; bioconcentration

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一類由2個(gè)或2個(gè)以上芳烴(苯)環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列構(gòu)成的碳?xì)浠衔铮哂泻軓?qiáng)的致癌、致畸和致基因突變作用[1-2]。該類物質(zhì)隨著苯環(huán)數(shù)量的增多，其辛醇-水分配系數(shù)增加，水溶性降低而脂溶性增強(qiáng)[3]，極易吸附于有機(jī)顆粒物上，進(jìn)而蓄積在有機(jī)體和沉積質(zhì)中[4]，并可通過食物鏈的放大作用危害人類健康。近海岸沉積質(zhì)中的PAHs主要來源于近岸溢油、石化污染以及陸源排放[5-6]。目前已有多種PAHs被美國(guó)環(huán)境保護(hù)署列入優(yōu)先控制有機(jī)污染物，其中包括芘(pyrene, PY)。芘在環(huán)境中普遍存在[7]，常作為PAHs的代表物用于各項(xiàng)毒理學(xué)和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的研究[8-9]。

多毛類是一類廣泛棲居于污染物較為匯集的海陸交錯(cuò)帶沉積質(zhì)中具有典型沉積食性的底棲無脊椎動(dòng)物[10]。多毛類動(dòng)物的不易長(zhǎng)距離遷移的特點(diǎn)，使其極易通過直接接觸和主動(dòng)攝食接觸到沉積質(zhì)中的污染物，近年來常被用作海洋沉積質(zhì)污染評(píng)價(jià)的物種[11]。研究表明一些種類的多毛類動(dòng)物對(duì)重金屬和石油烴等污染物具有較強(qiáng)的耐受和富集作用[12-13]，可通過一系列分解和轉(zhuǎn)化作用將有毒有害的污染物排出體外，維持機(jī)體對(duì)污染物較高的生物可利用性[14]，因此，這些種類的多毛類動(dòng)物也被用作近海岸污染沉積質(zhì)生境修復(fù)的物種。

生物可利用性的實(shí)質(zhì)在于研究化學(xué)物質(zhì)與生物體的一種潛在的相互關(guān)系，由間接的毒性數(shù)據(jù)或生物體濃度數(shù)據(jù)來評(píng)價(jià)，對(duì)生物修復(fù)、污染物的生態(tài)毒性和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)具有重要影響[15-16]。目前，近海岸沉積質(zhì)中PAHs的生物可利用性研究已有相關(guān)報(bào)道，主要集中在少數(shù)多毛類物種上，有關(guān)PAHs在我國(guó)海陸交錯(cuò)帶分布廣泛的多毛類動(dòng)物—雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)體內(nèi)的生物可利用性研究尚未多見。

本研究以P. aibuhitensis為研究對(duì)象，以芘作為暴露污染物，開展P. aibuhitensis對(duì)芘的生物可利用性研究，分別考察了芘對(duì)P. aibuhitensis體內(nèi)主要抗氧化酶活性的影響以及芘在P. aibuhitensis體內(nèi)的生物富集特征，旨在為近海岸沉積質(zhì)中PAHs的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)及其污染生境的修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用P. aibuhitensis采自遼寧大連海域，個(gè)體質(zhì)量為(2.5±0.5) g，將采集的個(gè)體放入塑料箱后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間，每24 h更換一次海水，水溫為(13±0.5) ℃，鹽度為31～32，pH為8.25±0.10。供試土壤采自遼寧金州沿海灘涂，干燥后用40目分樣篩篩去碎石，其相關(guān)理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果如表1。

實(shí)驗(yàn)用分析純芘購于Sigma公司(純度為99%)，分析純丙酮購于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純無水硫酸鈉購自廣州化學(xué)試劑公司，分析純正己烷、二氯甲烷和硫酸溶液以及層析純中性氧化鋁(200～300目)和弗羅里硅土(60～100目)均購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，考馬斯亮蘭試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒、過氧化氫酶(catalase, CAT)試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芘的毒性實(shí)驗(yàn)

[17]、[18]中的方法，設(shè)置3個(gè)不同濃度芘溶液暴露組，分別為5 μg·L-1、25 μg·L-1和50 μg·L-1，另設(shè)一空白對(duì)照組和體積分?jǐn)?shù)為0.01%的丙酮溶劑對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。挑取健康P. aibuhitensis個(gè)體，放入2 L預(yù)先加入500 mL不同濃度芘溶液的塑料杯中，每個(gè)杯中放入6尾P. aibuhitensis，每24 h更換一次新的溶液，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程不投喂飼料，實(shí)驗(yàn)期間，水溫維持在(13±0.5) ℃。于實(shí)驗(yàn)開始后第4、7和14天分別從各處理組中隨機(jī)取3尾P. aibuhitensis，取其體壁肌肉組織立即放入超低溫冰箱(-80 ℃)中保存，用于后續(xù)進(jìn)行P. aibuhitensis酶活的測(cè)定。

表1 供試土壤背景值Table 1 Background value of the tested soil

1.2.2 生物富集模型構(gòu)建與管理

在實(shí)驗(yàn)室條件下構(gòu)建垂直潛流人工濕地微宇宙生態(tài)系統(tǒng)，其由上箱和下箱組成，上箱為規(guī)格0.45 m×0.31 m×0.20 m的塑料箱，于塑料箱體頂部一側(cè)安裝入水管一支，并于每個(gè)塑料箱底部分別鉆9個(gè)直徑為0.5 cm的圓孔。每個(gè)塑料箱底部鋪墊80～100目篩絹以防止土壤流失，放入5 kg實(shí)驗(yàn)土壤。下箱規(guī)格為0.60 m×0.40 m×0.15 m，如圖1所示。

實(shí)驗(yàn)采取“靜態(tài)法”[19]將土壤經(jīng)芘一次性暴露染毒，連續(xù)檢測(cè)土壤中和P. aibuhitensis體內(nèi)芘的濃度。參考文獻(xiàn)[20]中的方法，分別設(shè)置3個(gè)不同濃度芘土壤暴露組，分別為100 mg·kg-1、200 mg·kg-1和400 mg·kg-1，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。以正己烷作為芘的溶劑，將稱好質(zhì)量的芘放入適量體積的正己烷中溶解。將配制好的芘溶液噴灑入土壤中，混合均勻，放置7 d，使其與土壤達(dá)到充分平衡。實(shí)驗(yàn)微宇宙每箱放置P. aibuhitensis 25尾(按180尾/m2計(jì))，模擬潮汐規(guī)律，每日早8時(shí)和晚5時(shí)用海水澆灌，并收集塑料箱底部滲出海水，重新置入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)。分別于實(shí)驗(yàn)第2天至第22天，每2天取一次樣，整體取樣，每次分別從各處理組取3條完整P. aibuhitensis，海水清洗后，于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)進(jìn)行P. aibuhitensis體內(nèi)芘的蓄積量的測(cè)定。

1.2.3 酶活測(cè)定方法

SOD、CAT和GSH-PX活性均采用南京建成生物工程研究所試劑盒方法測(cè)定。蛋白質(zhì)含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒方法——考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

圖1 微宇宙生態(tài)系統(tǒng)截面示意圖Fig. 1 Schematic diagram of microcosm ecosystem

1.2.4 雙齒圍沙蠶體內(nèi)芘的提取

參考文獻(xiàn)[21]中樣品的前處理方法，取肌肉組織勻漿。稱取已制成均勻肉糜的樣品2 g，加入2 g無水硫酸鈉研磨均勻后，將樣品置于10 mL具塞離心管中，以正己烷-二氯甲烷(體積比為2∶1)作為溶劑進(jìn)行超聲提取，提取液經(jīng)60%硫酸溶液和中性氧化鋁-弗羅里硅土混合層析柱凈化。用正己烷定容至1 mL，轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

1.2.5 雙齒圍沙蠶體內(nèi)芘濃度的測(cè)定

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)進(jìn)行定性和定量分析，采用外標(biāo)法，首先對(duì)不同濃度芘的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行SIM掃描，繪制芘的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算芘的濃度。GC-MS配置與參數(shù)見表2，升溫程序?yàn)椋褐跏紲?0 ℃，保持1 min，再以20 ℃·min-1升至100 ℃，然后以10 ℃·min-1升至210 ℃，保持1 min，最后以5 ℃·min-1升至290 ℃，保持5 min。

表2 GC-MS配置與參數(shù)Table 2 Configuration and parameters of GC-MS

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

1.3.1 差異顯著性分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0進(jìn)行處理，采用單因素方差(ANOVA)及其Duncan多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性水平P<0.05或P<0.01表示差異顯著；結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)形式表示。

1.3.2 雙齒圍沙蠶體內(nèi)芘生物富集動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算

應(yīng)用生物富集過程動(dòng)力學(xué)模型[22]計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)得到P. aibuhitensis對(duì)芘的生物富集系數(shù)，即根據(jù)測(cè)得的P. aibuhitensis體內(nèi)芘的蓄積量，通過公式(1)和(2)對(duì)不同暴露濃度下P. aibuhitensis芘的蓄積量隨時(shí)間變化進(jìn)行Origin非線性擬合，得到K1和K2的值，再通過公式(3)和(4)計(jì)算生物富集系數(shù)(biological concentration factor, BCF)和富集平衡狀態(tài)下，P. aibuhitensis體內(nèi)污染物的最大蓄積量(CAmax)。

蓄積階段：CA=C0+CW·K1/K2·(1-e-k2t)

(1)

排放階段(t>t*)：CA=CW·K1/K2·(e-k2t(t-t*)-e-k2t)

(2)

生物富集系數(shù)：BCF=K1/K2

(3)

平衡狀態(tài)下的最大蓄積量：CAmax=BCF×CW

(4)

式中：K1—生物吸收速率常數(shù)，K2—生物排出速率常數(shù)，CW—底質(zhì)污染物濃度(mg·kg-1)，CA—t時(shí)刻生物體內(nèi)污染物濃度(mg·kg-1)，C0—初始時(shí)刻生物體內(nèi)污染物濃度(mg·kg-1)，t—實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的時(shí)間。

2 結(jié)果(Results)

2.1 芘脅迫對(duì)雙齒圍沙蠶抗氧化酶活性的影響

2.1.1 芘脅迫對(duì)雙齒圍沙蠶SOD活性的影響

從圖2至圖4可以看出，溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組的3種抗氧化酶活性均無明顯差異(P>0.05)，表明丙酮作為助溶劑對(duì)P. aibuhitensis沒有明顯的毒性效應(yīng)。從圖2可以看出，各濃度梯度芘脅迫下，P. aibuhitensis SOD活性均隨時(shí)間的增加而逐漸升高。在5 μg·L-1芘中暴露4、7和14 d時(shí)，SOD活性分別為溶劑對(duì)照組的1.38、1.7和2.08倍；在25 μg·L-1芘中暴露4、7和14 d時(shí)，SOD活性分別為溶劑對(duì)照組的1.21、1.46和1.66倍；50 μg·L-1芘中暴露4、7和14 d時(shí)，SOD活性分別為溶劑對(duì)照組的1.12、1.25和1.32倍。對(duì)同一時(shí)間不同處理組進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)在第4、7和14天時(shí)，各濃度梯度芘脅迫下，P. aibuhitensis SOD活性較溶劑對(duì)照組均出現(xiàn)顯著升高(P<0.01)；經(jīng)Duncan多重比較后，發(fā)現(xiàn)在第4、7和14天時(shí)，5 μg·L-1芘脅迫下SOD活性均顯著高于25 μg·L-1芘脅迫下SOD活性(P<0.01)，25 μg·L-1芘脅迫下SOD活性均顯著高于50 μg·L-1芘脅迫下SOD活性(P<0.01)，SOD活性隨芘濃度的升高出現(xiàn)顯著下降。

圖2 芘脅迫對(duì)雙齒圍沙蠶SOD活性的影響Fig. 2 The effect of pyrene on activities of SOD in P. aibuhitensis

2.1.2 芘脅迫對(duì)雙齒圍沙蠶CAT活性的影響

從圖3可以看出，各濃度梯度芘脅迫下，P. aibuhitensis CAT活性均隨時(shí)間的增加而逐漸升高。在5 μg·L-1芘中暴露4、7和14 d時(shí)，CAT活性分別為溶劑對(duì)照組的1.15、1.2和1.35倍；在25 μg·L-1芘中暴露4、7和14 d時(shí)，CAT活性分別為溶劑對(duì)照組的1.31、1.47和1.62倍；50 μg·L-1芘中暴露4、7和14 d時(shí)，CAT活性分別為溶劑對(duì)照組的1.64、1.74和1.9倍。對(duì)同一時(shí)間不同處理組進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)在第4、7和14天時(shí)，各濃度梯度芘脅迫下，P. aibuhitensis CAT活性較溶劑對(duì)照組均出現(xiàn)顯著升高(P<0.01)；經(jīng)Duncan多重比較后，發(fā)現(xiàn)在第4、7和14天時(shí)，25 μg·L-1芘脅迫下CAT活性均顯著高于5 μg·L-1芘脅迫下CAT活性(P<0.01)，50 μg·L-1芘脅迫下CAT活性均顯著高于25 μg·L-1芘脅迫下CAT活性(P<0.01)，CAT活性隨芘濃度的升高出現(xiàn)顯著升高，這一變化趨勢(shì)與SOD相反。

圖3 芘脅迫對(duì)雙齒圍沙蠶CAT活性的影響Fig. 3 The effect of pyrene on activities of CAT in P. aibuhitensis

2.1.3 芘脅迫對(duì)雙齒圍沙蠶GSH-PX活性的影響

從圖4可以看出，各濃度梯度芘脅迫下，P. aibuhitensis GSH-PX活性變化趨勢(shì)與SOD和CAT相類似，均隨時(shí)間的增加而逐漸升高。在5 μg·L-1芘中暴露4、7和14 d時(shí)，GSH-PX活性分別為溶劑對(duì)照組的2.33、3.55和3.86倍；在25 μg·L-1芘中暴露4、7和14 d時(shí)，GSH-PX活性分別為溶劑對(duì)照組的2.58、3.86和4.18倍；50 μg·L-1芘中暴露4、7和14 d時(shí)，GSH-PX活性分別為溶劑對(duì)照組的3.27、4.37和4.68倍。對(duì)同一時(shí)間不同處理組進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)在第4、7和14天時(shí)，各濃度梯度芘脅迫下，P. aibuhitensis GSH-PX活性較溶劑對(duì)照組均出現(xiàn)顯著升高(P<0.01)；經(jīng)Duncan多重比較后，發(fā)現(xiàn)在第4、7和14天時(shí)，25 μg·L-1芘脅迫下GSH-PX活性均顯著高于5 μg·L-1芘脅迫下GSH-PX活性(P<0.01)，50 μg·L-1芘脅迫下GSH-PX活性均顯著高于25 μg·L-1芘脅迫下GSH-PX活性(P<0.01)，GSH-PX活性隨芘濃度的升高出現(xiàn)顯著升高，這一變化趨勢(shì)與CAT相類似，與SOD相反。

圖4 芘脅迫對(duì)雙齒圍沙蠶GSH-PX活性的影響Fig. 4 The effect of pyrene on activities of GSH-PX in P. aibuhitensis

2.2 芘在雙齒圍沙蠶體內(nèi)的生物富集特征

2.2.1 雙齒圍沙蠶體內(nèi)芘的蓄積變化規(guī)律

在不同暴露濃度下，P. aibuhitensis體內(nèi)芘的蓄積量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)如圖5。由圖5可見，總體來看，P. aibuhitensis體內(nèi)芘的蓄積量隨暴露濃度的增加而增加，各處理組P. aibuhitensis體內(nèi)芘的蓄積量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)均呈類凸形的二次曲線關(guān)系且各處理組均在第10天達(dá)到蓄積的最大值。暴露濃度為100、200和400 mg·kg-1時(shí)最大蓄積量依次為(6.18±0.62) mg·kg-1、(12.37±1.23) mg·kg-1和(24.76±1.51) mg·kg-1，分別相當(dāng)于各處理組P. aibuhitensis體內(nèi)初始濃度的6.06、10.06和18.21倍，較初始濃度有顯著差異(P<0.01)。在0～10 d，各處理組P. aibuhitensis體內(nèi)芘的日均累積量隨暴露濃度增加依次為(0.62±0.06) mg·kg-1、(1.24 ±0.12) mg·kg-1和(2.48±0.15) mg·kg-1。第10天之后，各處理組P. aibuhitensis體內(nèi)芘的蓄積量均呈下降趨勢(shì)。在第10～22天，P. aibuhitensis體內(nèi)芘的日均下降量隨暴露濃度增加依次為(0.52±0.05) mg·kg-1、(1.03±0.10) mg·kg-1和(2.06±0.13) mg·kg-1。暴露實(shí)驗(yàn)至第22天時(shí)，各處理組P. aibuhitensis體內(nèi)芘的蓄積量已接近初始濃度，隨暴露濃度依次為(1.06±0.21) mg·kg-1、(2.13±0.31) mg·kg-1和(4.28±0.82) mg·kg-1。

圖5 各處理組雙齒圍沙蠶體內(nèi)芘的蓄積量隨時(shí)間的變化Fig. 5 The accumulation amount of pyrene in P. aibuhitensis in different treatment groups at different exposure times

2.2.2 雙齒圍沙蠶對(duì)芘的生物富集動(dòng)力學(xué)參數(shù)

根據(jù)圖5所得數(shù)據(jù)，應(yīng)用生物富集過程動(dòng)力學(xué)模型對(duì)不同暴露濃度下P. aibuhitensis體內(nèi)芘的蓄積量隨時(shí)間的變化進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果如圖6所示，各處理組P. aibuhitensis的K1變動(dòng)于0.00966～0.01343，K2變動(dòng)于0.13967～0.19921，通過公式(3)計(jì)算得出，P. aibuhitensis的BCF隨土壤中芘濃度的增加而減小，分別為0.0692、0.0684和0.0674。通過公式(4)計(jì)算得出，在平衡狀態(tài)下，P. aibuhitensis的CAmax隨土壤中芘濃度的增加而增加，分別為6.92 mg·kg-1、13.68 mg·kg-1和26.96 mg·kg-1。

3 討論(Discussion)

3.1 芘脅迫對(duì)雙齒圍沙蠶抗氧化酶活性的影響

污染物進(jìn)入到生物體內(nèi)會(huì)經(jīng)過一系列的生物轉(zhuǎn)化，在此過程中會(huì)產(chǎn)生一定量的活性氧自由基，機(jī)體若不及時(shí)清除會(huì)產(chǎn)生氧化損傷。機(jī)體在氧化損傷過程中，SOD、CAT和GSH-PX是3種起主要作用的酶，SOD是生物體內(nèi)唯一一種以自由基為底物的抗氧化酶，可將超氧陰離子歧化為H2O2和O2，以避免細(xì)胞受到氧自由基的損害[23-24]；CAT是生物體內(nèi)抗氧化體系中又一關(guān)鍵非特異性抗氧化酶，能清除SOD催化活性氧自由基所產(chǎn)生的H2O2，使其轉(zhuǎn)化為無毒的H2O和O2，從而使機(jī)體免受氧自由基的攻擊[25]；GSH-PX也是生物體內(nèi)一種普遍存在的抗氧化酶，可以降低內(nèi)外有毒物質(zhì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的毒性作用，又可分解H2O2以及清除細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)和機(jī)體過氧反應(yīng)的產(chǎn)物，以達(dá)到保護(hù)細(xì)胞機(jī)構(gòu)和功能完整的作用[26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在不同濃度芘的暴露下，P. aibuhitensis的這3種抗氧化酶活性均隨著芘暴露時(shí)間的增加呈明顯的上升趨勢(shì)，表明隨著暴露時(shí)間的增加，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，SOD活性的升高可以消除氧自由基。CAT活性變化趨勢(shì)與GSH-PX相類似，這2種酶活性的升高可以去除代謝過程中產(chǎn)生的H2O2，從而減少生物體受到氧化損傷的風(fēng)險(xiǎn)。這一變化趨勢(shì)與其他研究結(jié)果相類似[27-30]。

圖6 各處理組雙齒圍沙蠶對(duì)芘的生物富集曲線注：A, B, C中芘初始濃度分別為100、200和400 mg·kg-1。Fig. 6 The bioconcentration curves of pyrene in P. aibuhitensis at different treatment groupsNote: The initial concentration of pyrene were 100, 200 and 400 mg·kg-1respectively in A, B and C.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中SOD與CAT和GSH-PX活性隨暴露濃度的變化趨勢(shì)并不一致，在25 μg·L-1芘誘導(dǎo)下，P. aibuhitensis SOD活性的上升趨勢(shì)明顯低于5 μg·L-1濃度組；在50 μg·L-1芘誘導(dǎo)下，P. aibuhitensis SOD活性的上升趨勢(shì)明顯低于25 μg·L-1濃度組，P. aibuhitensis SOD活性隨暴露濃度的增加而降低，而CAT和GSH-PX活性則隨暴露濃度的增加而升高。不少研究表明SOD與CAT和GSH-PX隨暴露濃度的變化趨勢(shì)存在相似性，也有研究發(fā)現(xiàn)SOD與CAT和GSH-PX隨暴露濃度的變化趨勢(shì)相反。本實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能與CYP家族參與PAHs的代謝有關(guān)。Livingstone等[31]在研究沙丁魚(Limanda limanda)的抗氧化酶活性時(shí)發(fā)現(xiàn)SOD和CAT的變化趨勢(shì)并不一致，推斷原因是由于H2O2的來源除來自SOD催化外，還可來自氨基酸和細(xì)胞色素P450氧化酶(cytochrome p450, CYP450)的激活。趙歡等[18]在研究苯并芘對(duì)P. aibuhitensis的抗氧化酶活性時(shí)也發(fā)現(xiàn)SOD與CAT和GSH-PX隨暴露濃度的變化趨勢(shì)并不一致，在進(jìn)行苯并芘對(duì)P. aibuhitensis抗氧化酶活性影響研究的同時(shí)，也進(jìn)行了苯并芘對(duì)P. aibuhitensis CYP450基因表達(dá)的影響分析，發(fā)現(xiàn)苯并芘會(huì)顯著誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。故推斷本實(shí)驗(yàn)中，SOD與CAT和GSH-PX的變化趨勢(shì)相反是由于P. aibuhitensis體內(nèi)H2O2的來源有一部分是通過CYP450激活產(chǎn)生的。綜合上述研究結(jié)果，在一定濃度范圍內(nèi)，P. aibuhitensis體內(nèi)SOD、CAT和GSH-PX活性與芘之間存在明顯的“時(shí)間-效應(yīng)”和“劑量-效應(yīng)”關(guān)系。

3.2 芘在雙齒圍沙蠶體內(nèi)的生物富集特征

本實(shí)驗(yàn)考察了芘在P. aibuhitensis體內(nèi)的生物富集特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0～10 d，P. aibuhitensis體內(nèi)芘的蓄積量隨暴露時(shí)間和暴露濃度的增加均呈升高趨勢(shì)且均在第10天時(shí)達(dá)到蓄積的最大值，較體內(nèi)初始濃度存在顯著性差異(P<0.05)，這表明P. aibuhitensis暴露于芘后，在初始階段的生物富集效應(yīng)較為顯著。陶宇[32]在研究P. aibuhitensis對(duì)菲的生物富集時(shí)也曾發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，P. aibuhitensis在暴露于菲濃度為400 mg·kg-1的土壤中時(shí)，其體內(nèi)菲的蓄積量隨暴露時(shí)間的增加而增加，在第9天時(shí)達(dá)到蓄積的最大值，較體內(nèi)初始濃度存在顯著性差異(P<0.05)。

在10～22 d，各處理組P. aibuhitensis體內(nèi)芘的蓄積量隨時(shí)間的增加均呈降低趨勢(shì)。在第18天時(shí)，各處理組P. aibuhitensis體內(nèi)芘的蓄積量開始趨于初始濃度水平，至22 d時(shí)，各處理組P. aibuhitensis體內(nèi)芘的蓄積量雖仍高于初始濃度，但已與初始濃度無顯著性差異(P>0.05)。顯然在第10天后，P. aibuhitensis對(duì)芘的代謝大于蓄積。已有研究表明海洋多毛類動(dòng)物在去除體內(nèi)蓄積的PAHs時(shí)，其重要方式就是通過生物轉(zhuǎn)化的多個(gè)代謝途徑使疏水性PAHs轉(zhuǎn)化為親水性化合物，從而排除體外，這一反應(yīng)分為2個(gè)階段，第一階段主要由CYP450作用下使PAHs發(fā)生羥基化反應(yīng)；第二階段由二磷酸尿核苷葡萄糖醛氨酰轉(zhuǎn)移酶和磺基轉(zhuǎn)移酶參與，與羥基化的PAHs反應(yīng)生成水溶性代謝產(chǎn)物[14]。由此推斷實(shí)驗(yàn)最初的0～10 d內(nèi)，P. aibuhitensis對(duì)芘的蓄積速率大于代謝速率，表現(xiàn)為蓄積作用；在10～22 d內(nèi)，P. aibuhitensis對(duì)芘的代謝速率大于蓄積速率，表現(xiàn)為排泄作用。

Meador等[33]在總結(jié)大量已報(bào)道文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上認(rèn)為BCF決定了生物體對(duì)污染物的富集能力，在污染物低暴露水平時(shí)，BCF值較高；在高暴露水平時(shí)，BCF值較低。本研究得到的結(jié)果與該規(guī)律一致，即隨著土壤中芘濃度的增加，BCF逐漸下降，P. aibuhitensis對(duì)芘的富集能力逐漸降低。此外，本實(shí)驗(yàn)所得BCF值與紫貽貝(Mytilus edulis)和菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)等海洋無脊椎生物對(duì)石油烴的生物富集所得BCF值具有較大差異[34-35]。推斷可能是由于PAHs、石油烴等持久性有機(jī)污染物在生物組織中的富集受到諸多因素的影響，如食物可獲性、生物體的生理狀態(tài)以及生物組織的脂肪含量等，因此不同種類間所得BCF值可能存在較大差異[34-35]。

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◆

BioavailablilityofPyreneinthePerinereisaibuhitensis

Cai Fucai, Zhao Huan, Li Yannan, Zhang Wenlong, Yang Dazuo, Zhou Yibing*

Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170114006

2017-01-14錄用日期2017-03-13

1673-5897(2017)3-620-09

X171.5

A

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41306138)；海洋公益性行業(yè)專項(xiàng)(201305002，201305043)；遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(L201608)

蔡富才(1991-)，男，碩士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊鷳B(tài)毒理學(xué)及海洋污染生境修復(fù)，E-mail: caifucai520@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: ybzhou@dlou.edu.cn

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