文/賈 濤

（北京市飼料監(jiān)察所）

牛奶中硝基咪唑類藥物的測(cè)定

文/賈 濤

（北京市飼料監(jiān)察所）

牛奶樣品經(jīng)乙酸乙脂提取、正己烷去脂、MCX凈化小柱凈化后過(guò)膜，注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)儀。試驗(yàn)顯示：濃度為0、2.0、4.0、20.0、40.0、200.0、400.0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2值均大于0.995；回收率為86.7%～89.2%，變異系數(shù)小于15%，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法能夠達(dá)到靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度的要求。

牛奶；硝基咪唑；測(cè)定分析

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甲硝唑、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥基地美硝唑?qū)φ掌罚杭兌炔恍∮?5%。甲硝唑-D3、地美硝唑-D3、羥基甲硝唑-D2、羥基地美硝唑-D3對(duì)照品：純度不小于95%。乙酸乙酯（色譜純），乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），鹽酸（優(yōu)級(jí)純），正己烷（分析純），氨水（分析純），甲酸（色譜純）。

1.2 溶液配制

1.2.1 鹽酸溶液

鹽酸溶液（0.1 mol/L）：取8.3 mL濃鹽酸，加水稀釋定容至1 000 mL，混勻。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg/mL）：分別稱取適量的甲硝唑、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥基地美硝唑?qū)φ掌?，用甲醇溶解配制? 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃冰箱中保存。

1.2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10 μg/mL）：分別準(zhǔn)確量取0.1 mL甲硝唑、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥基地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，-20 ℃冰箱中保存。

1.2.4 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液

取適量的10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，-20 ℃冰箱中保存。

1.2.5 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（1 000 μg/mL）：分別稱取適量的甲硝唑-D3、地美硝唑-D3、羥基甲硝唑-D2、羥基地美硝唑-D3對(duì)照品，用甲醇溶解配制成1 000 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，-20 ℃冰箱中保存。

1.2.6 混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液

混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（10 μg/mL）：分別準(zhǔn)確量取0.1 mL甲硝唑-D3、地美硝唑-D3、羥基甲硝唑-D2、羥基地美硝唑-D3內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，-20 ℃冰箱中保存。

1.2.7 混合內(nèi)標(biāo)工作液

混合內(nèi)標(biāo)工作液（0.1 μg/mL）：準(zhǔn)確量取0.1 mL混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（10 μg/mL）至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，-20 ℃冰箱中保存。

1.3 儀器及設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源），天平（感量0.01 g和0.00001 g），高速冷凍離心機(jī)，渦旋混合器，固相萃取裝置，氮吹儀，濾膜（0.2 μm），MCX固相萃取柱（60 mg/3 mL）。

2 測(cè)定

2.1 樣品前處理

稱?。?.00±0.02）g牛奶試樣于50 mL離心管中，添加100 μL 0.1 μg/mL內(nèi)標(biāo)工作液，渦動(dòng)30 s混勻，靜置10 min。加15 mL乙酸乙酯，渦動(dòng)2 min，10 000 r/min離心5 min。上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，殘?jiān)?5 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，20 ℃水浴氮?dú)獯蹈?。?.1 mol/L鹽酸5 mL，渦動(dòng)1 min充分溶解殘?jiān)?，? mL正己烷，手搖20 次，5 000 r/min離心5 min，棄正己烷層。下層再加5 mL正己烷重復(fù)去脂一次，除盡正己烷層，備用。MCX固相萃取柱依次用2 mL甲醇和2 mL 0.1 mol/L鹽酸活化，取備用液全部過(guò)柱，再依次用2 mL 0.1 mol/L鹽酸、1 mL甲醇、1 mL 2%氨水淋洗，用2 mL甲醇-水-氨水（80%-15%-5%）洗脫。洗脫液20 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑?.5 mL水渦動(dòng)1 min復(fù)溶，過(guò)濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2.2 液相色譜條件

色譜柱：C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）。

流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸乙腈溶液。

要實(shí)施環(huán)境影響評(píng)價(jià)法，就要加大對(duì)違法行為的處罰力度。對(duì)于施工時(shí)破壞環(huán)境的企業(yè)不僅要交罰金，還要讓他們停止施工。對(duì)于排放污染物出現(xiàn)超標(biāo)問(wèn)題，要根據(jù)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行處罰，同時(shí)不審批環(huán)境影響評(píng)價(jià)。

流速：0.3 mL/min。

柱溫：30 ℃。

進(jìn)樣量：10μL。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

表2 定性、定量離子及錐孔電壓、碰撞能量

表3 硝基咪唑標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R2值）

2.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源。

檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

電離電壓：3.0 kV。

源溫：100 ℃。

霧化溫度：350 ℃。

錐孔氣流速：30 L/h。

霧化氣流速：600 L/h。

定性、定量離子及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓、碰撞能量見表2。

3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

制備一系列牛奶基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為0、2.0、4.0、20.0、40.0、200.0、400.0 μg/L，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出的回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R2值）見表3。

3.2 靈敏度

以3 倍信噪比為檢測(cè)限，10 倍信噪比為定量限，該方法的檢測(cè)限和定量限分別能達(dá)到0.5μg/kg和1.0 μg/kg。

3.3 準(zhǔn)確度和精密度

將硝基咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到不同空白牛奶中，使樣品中硝基咪唑類藥物濃度為定量限（1.0 μg/kg），按樣品處理方法提取、凈化，然后進(jìn)行LC-MS/MS分析。批內(nèi)進(jìn)行5 個(gè)重復(fù)，批間進(jìn)行3 批次試驗(yàn)。用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算回收率，批內(nèi)、批間變異系數(shù)見表4。

表4 牛奶中硝基咪唑類藥物濃度定量限位1.0μg/kg添加的回收結(jié)果

4 結(jié)論

硝基咪唑在牛奶中的回收率為86.7%～89.2%，變異系數(shù)小于15%，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能夠達(dá)到靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度的要求。

2017-06-15）

賈濤，北京市飼料監(jiān)察所，高級(jí)畜牧師，理化檢驗(yàn)室檢驗(yàn)員，質(zhì)量監(jiān)督員，從事飼料與生乳檢測(cè)、調(diào)研及質(zhì)量監(jiān)督工作。