古 俊,郭 樂,劉金彪,霍文哲

(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430071)

·論著·

BBI抑制LPS誘導(dǎo)的腸道上皮細胞炎性因子的表達

古 俊,郭 樂,劉金彪,霍文哲

(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430071)

目的探討大豆來源的胰蛋白酶抑制劑(BBI)對LPS誘導(dǎo)的腸道上皮細胞炎性因子表達的抑制作用及其機制。方法用MTT法檢測LPS和BBI對腸道上皮細胞的毒性作用。先用BBI預(yù)處理腸道上皮細胞，再用LPS刺激，采用實時熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-8和MCP-1)的表達，通過NF-κB-luc熒光素酶質(zhì)粒和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測NF-κB的活性。結(jié)果LPS最大濃度(10 000 ng/mL)和BBI最大濃度(1 000 μg/mL)對細胞均無毒性作用。LPS處理可顯著地上調(diào)腸道上皮細胞炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-8和MCP-1)的表達，其上調(diào)作用和LPS的濃度成正相關(guān)；LPS處理腸道上皮細胞3 h后炎性因子表達最高，隨時間延長有所下降；LPS對腸道上皮細胞炎性因子的上調(diào)作用具有劑量和時間效應(yīng)；BBI預(yù)處理腸道上皮細胞6 h時，BBI對LPS誘導(dǎo)腸道上皮細胞炎性因子表達的抑制作用最明顯，且具有劑量效應(yīng)。結(jié)論通過對腸道上皮細胞內(nèi)NF-κB的抑制，BBI能夠顯著地抑制LPS誘導(dǎo)炎癥因子的表達。

胰蛋白酶抑制劑； BBI； 腸道上皮細胞； 炎性反應(yīng)； NF-κB

[Chin J Infect Control，2017，16(10)：893-898]

慢性系統(tǒng)性炎癥及免疫激活是促進人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)感染和艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)進展的主要因素之一。由于腸道中存在大量被細菌及其產(chǎn)物激活的CD4+T細胞—HIV-1感染的主要靶細胞，腸道系統(tǒng)成為病毒進入機體后的首要和主要場所[1]。由于受到HIV-1的攻擊，腸道內(nèi)大量的CD4+T細胞死亡，防御力降低，菌群失調(diào)，細菌及其產(chǎn)物如內(nèi)毒素(LPS)大量增加[2-3]。上述變化引起腸道炎癥，腸壁黏膜通透性增加，細菌及其產(chǎn)物L(fēng)PS易位(Microbial translocation)，進入血液循環(huán)[4]。LPS能刺激單核巨噬細胞產(chǎn)生和釋放包括TNF-α、IL-1β、IL-8和MCP-1在內(nèi)的炎性因子，造成全身性炎癥和免疫激活(systemic inflammation and immune activation)[5-6]。因此，機體內(nèi)更多CD4+T細胞被激活，成為HIV-1的靶細胞，病毒得以大量繁殖，CD4+T細胞被逐漸消耗，疾病進程加速[7]。盡管抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(antiretroviral therapy, ART)能顯著地抑制感染者體內(nèi)HIV-1的復(fù)制，降低發(fā)病率和病死率，但患者體內(nèi)的慢性炎癥和免疫激活依然存在[8]，是導(dǎo)致HIV-1在感染者體內(nèi)持續(xù)存在，CD4+T細胞不斷丟失的主要原因[9]。因此，干預(yù)HIV-1感染造成的腸道炎癥及免疫激活是目前AIDS研究的重點。

胰蛋白酶抑制劑(soybean-derived Bowman-Birk inhibitor，BBI)是大豆中富含的一類具有耐酸性的胰蛋白酶抑制劑，存在于豆奶等許多豆制品中，具有較好的抗炎功效[10]?？诜﨎BI即顯示出良好的免疫調(diào)節(jié)作用，對自身免疫性疾病有較好的潛在治療效果[11]。我們的前期工作顯示，BBI能顯著地激活巨噬細胞內(nèi)抗病毒天然免疫，從而抑制HIV-1的感染和復(fù)制[12]。本研究以抑制細菌內(nèi)毒素LPS造成的腸道上皮細胞炎癥為目的，選擇既有抗炎作用又能抑制HIV-1的天然產(chǎn)物BBI，研究BBI是否能抑制LPS誘導(dǎo)的腸道上皮細胞炎性因子的表達，并探討相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.2 毒性實驗 用MTT法檢測LPS和BBI對腸道上皮細胞(HT-29細胞，人直結(jié)腸癌細胞系)的毒性作用。在96孔細胞培養(yǎng)板(Corning, USA)中按104個/孔培養(yǎng)腸道上皮細胞，12 h 后用不同濃度的LPS(0、0.1、1、10、100、1 000、10 000 ng/mL)或BBI(0、25、50、100、200、400、600、1 000 μg/mL)處理細胞72 h。按體積比1∶10混合MTT溶液和DMEM(Gibico, USA)培養(yǎng)基，每孔加入100 μL，4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，700 r/min震蕩10 min，用全自動多功能酶標(biāo)儀(在波長490 nm處)檢測吸光度值。

1.3 細胞培養(yǎng) 用DMEM完全培養(yǎng)基 [含10%胎牛血清(Gibco, USA)、1%青-鏈霉素雙抗、和1%谷氨酰胺]培養(yǎng)腸道上皮細胞，置于37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在48孔細胞培養(yǎng)板(Corning, USA)中按105個/孔培養(yǎng)腸道上皮細胞24 h后，用LPS(10 ng/mL)處理細胞0、3、6、12或24 h，此外用不同濃度的LPS(0、0.1、1、10 ng/mL)處理細胞3 h。在BBI抑制實驗中，先用100 μg/ml BBI處理細胞不同時間(0、1、3、6、12 h)，或不同濃度BBI(25、50、100 μg/mL)預(yù)處理細胞6 h，再用LPS(10 ng/mL)處理細胞3 h。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR檢測炎性因子mRNA 用Tri-reagent提取細胞總RNA，并用NANODROP 2000超微量分光光度計(Thermo Scientific)檢測RNA濃度。根據(jù)廠家(Promega 公司)說明書方法，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑和隨機引物對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃ 1 h，然后95℃ 5 min終止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物4 ℃保存。實時熒光定量PCR用SYBR Green Supermix(Bio-Rad公司)試劑盒，反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s→60 ℃ 10 s，40個循環(huán)。所使用的引物見表1。Ct值相對CAPDH進行均一化，采用2-△△Ct法計算mRNA的表達水平。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.5 熒光素酶實驗 pNF-κB-Luc質(zhì)粒含有NF-κB啟動子，啟動子下游連接熒光素酶基因。用12孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)腸道上皮細胞(3×105個/孔)，待細胞長滿孔底80%后轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。按照廠家說明書用lipo3000轉(zhuǎn)染試劑(InvivoGen, USA)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6 h后用1×PBS洗2次，BBI(25、50、100 μg/mL)預(yù)處理細胞6 h后，再用LPS(10 ng/mL)處理細胞，12 h 后用1×PBS洗滌細胞2次，加入100 μL的1×cell lysis buffer(Promega, USA)裂解細胞。通過檢測細胞中pNF-κB-Luc質(zhì)粒表達的熒光素酶活性檢測細胞中NF-κB的激活情況。熒光素酶活性用熒光素酶試劑盒(Promega, USA)在全自動多功能酶標(biāo)儀上檢測。熒光素酶活性檢測結(jié)果用處理組和未處理組檢測值的比值，即相對光單位表示。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot) 在6孔板中按1×106個/孔培養(yǎng)HT-29細胞，進行處理后按照說明書用RIPA裂解液(碧云天)提取細胞蛋白。用10% SDS-PAGE膠分離20 μg蛋白，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用稀釋后的Phospho-NK-κB(Ser536)抗體(1∶1000)(碧云天)4℃孵育過夜，充分洗滌后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育，再用增強型化學(xué)發(fā)光劑ECL(碧云天)在化學(xué)發(fā)光成像儀上顯影。用Image J圖像分析軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 LPS和BBI對腸道上皮細胞無毒性作用 用不同濃度的LPS或BBI處理腸道上皮細胞72 h，MTT法檢測細胞活性，將未處理的細胞在波長490 nm 處的吸光度值定為1.0，以此計算處理細胞和未處理細胞的百分比值，重復(fù)3次實驗，每次實驗的三個復(fù)孔取均值±標(biāo)準(zhǔn)差，見圖1。處理的細胞和未處理細胞的活性相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，LPS最大濃度(10 000 ng/mL)和BBI最大濃度(1 000 μg/mL)對細胞均無毒性作用。

A：不同濃度LPS處理腸道上皮細胞72 h；B：不同濃度BBI處理腸道上皮細胞72 h

2.2 BBI抑制LPS誘導(dǎo)的炎性因子的表達 提取細胞總RNA，實時熒光定量PCR檢測細胞TNF-α、IL-1β、IL-8、MCP-1和內(nèi)參GAPDH的mRNA表達水平，數(shù)據(jù)采用 2-△△Ct法計算，重復(fù)3次實驗，取均值±標(biāo)準(zhǔn)差。見圖2。LPS處理可顯著地上調(diào)腸道上皮細胞炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-8和MCP-1)的表達，其上調(diào)作用和LPS的濃度成正相關(guān)(圖2A)。LPS處理腸道上皮細胞3 h后炎性因子表達最高，隨時間延長有所下降(圖2B)。LPS對腸道上皮細胞炎性因子的上調(diào)作用具有劑量和時間效應(yīng)。BBI預(yù)處理腸道上皮細胞6 h時，BBI對LPS誘導(dǎo)腸道上皮細胞炎性因子表達的抑制作用最明顯，且具有劑量效應(yīng)(圖2D)。

2.3 BBI抑制LPS對NF-κB的活化 用10 ng/mL LPS處理腸道上皮細胞，Western Blot分別檢測細胞中p-NF-κB、總NF-κB，以及內(nèi)參β-actin，LPS可激活腸道上皮細胞NF-κB，LPS對NF-κB的激活在1 h內(nèi)達到峰值(見圖3A)。NF-κB的激活水平和LPS的劑量成正相關(guān)，BBI可顯著地抑制LPS對NF-κB的激活(見圖3B)。

A: 不同濃度LPS處理腸道上皮細胞3 h；B:用10 ng/mL LPS處理腸道上皮細胞不同時間;C:先用100 μg/mL BBI預(yù)處理腸道上皮細胞不同時間(0、1、3、6、12 h)，再用10 ng/mL LPS處理3 h；D:不同濃度BBI預(yù)處理腸道上皮細胞6 h，再用10 ng/mL LPS處理3 h；*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；****：P<0.0001

A：用10 ng/mL LPS處理腸道上皮細胞不同時間；B：將pNF-κB-luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)入腸道上皮細胞后，按圖中所示劑量LPS刺激12 h，或按圖中所示BBI劑量預(yù)處理6 h，再用10 ng/mL LPS刺激12 h，檢測熒光素酶活性；**：P<0.01；***：P<0.001

3 討論

腸道黏膜炎癥是HIV-1感染的主要特癥之一。腸道炎癥會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，腸壁通透性增加和微生物易位，細菌產(chǎn)物如LPS進入血循環(huán)[13-14]。通過結(jié)合到單核巨噬細胞表面TLR4和CD14受體，LPS可激活細胞NF-κB信號通路，刺激細胞產(chǎn)生大量炎性因子[15]，包括TNF-α、IL-1β、IL-8和MCP-1，這些炎性因子被釋放到血循環(huán)中[16]。持續(xù)性的炎性反應(yīng)會導(dǎo)致腸道黏膜組織、免疫結(jié)構(gòu)以及天然屏障破壞，進一步促使腸道微生物易位[17]，形成惡性循環(huán)。除免疫細胞外，腸道內(nèi)非免疫細胞也可產(chǎn)生炎性因子[18-19]。本組數(shù)據(jù)顯示，LPS可誘導(dǎo)腸道上皮細胞產(chǎn)生大量的炎性因子，LPS誘導(dǎo)炎癥具有劑量和時間效應(yīng)。與我們先前研究LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細胞炎性因子表達結(jié)果一致，炎癥因子表達隨著時間逐漸降低[20]，可能是由于LPS隨時間效價降低，以及mRNA翻譯完成后發(fā)生降解導(dǎo)致的。LPS通過NF-κB通路誘導(dǎo)炎性因子的表達，且LPS的促炎作用急促，在15 min時便能顯著激活腸道上皮細胞NF-κB。BBI預(yù)處理能有效地抑制細胞內(nèi)NF-κB的激活以及炎性因子的表達。我們推斷BBI通過抑制LPS對NF-κB的激活，從而抑制LPS誘導(dǎo)的腸道上皮細胞炎性因子表達。

本研究發(fā)現(xiàn)，LPS能明顯地激活腸道上皮細胞內(nèi)NF-κB，上調(diào)腸道上皮細胞表達TNF-α、IL-1β、IL-8和MCP-1，此種激活和上調(diào)具有劑量和時間效應(yīng)。天然制劑大豆來源的胰蛋白酶抑制劑BBI能抑制LPS誘導(dǎo)的腸道上皮細胞NF-κB的激活，以及炎性因子的表達。高濃度BBI(1 000μg/mL)對腸道上皮細胞無毒性作用，而低濃度BBI(25 μg/mL)預(yù)處理腸道上皮細胞可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的炎性因子的表達，BBI對LPS的抑制作用具有劑量效應(yīng)。上述結(jié)果為BBI抑制LPS誘導(dǎo)腸道上皮細胞炎性反應(yīng)機制提供了實驗依據(jù)。

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(本文編輯：左雙燕)

BBIinhibitsLPS-inducedexpressionofinflammatorycytokinesinintestinalepithelialcells

GUJun,GUOLe,LIUJin-biao,HUOWen-zhe
(SchoolofBasicMedicalSciences,WuhanUniversity,Wuhan430071,China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect and mechanism of soybean-derived Bowman-Birk inhibitor (BBI) on LPS-induced expression of inflammatory cytokines in intestinal epithelial cells.MethodsCytotoxicity effect of LPS and BBI on intestinal epithelial cells was analyzed by MTT assay. Intestinal epithelial cells were pretreated with BBI, followed by LPS stimulation, expression of inflammatory cytokines(TNF-α, IL-1β, IL-8, and MCP-1) was detected by quantitative real-time polymerase chain reaction; the activation of NF-κB was measured by pNF-κB-luc system and Western Blot.ResultsThe maximum concentration of LPS(10 000 ng/mL) and BBI(1 000 μg/mL)had no cytotoxicity effect on intestinal epithelial cells. LPS could potently up-regulate the expression of inflammatory cytokines(TNF-α, IL-1β, IL-8, and MCP-1), the up-regulation was positively correlated to the concentration of LPS; LPS-induced expression of inflammatory cytokines in intestinal epithelial cells could achieve the highest level, then decreased over time. The up-regulation of LPS on inflammatory cytokines in intestinal epithelial cells had dose-time effect; when intestinal epithelial cells were pretreated by BBI for 6 hours, the inhibitory effect of BBI on LPS-induced expression of inflammatory cytokines in intestinal epithelial cells was most obvious, and had dose-time effect.ConclusionBBI can potently inhibit LPS-induced expression of inflammatory cytokines through inhibiting NF-κB in intestinal epithelial cells.

Bowman-Birk inhibitor; BBI; intestinal epithelial cell; inflammation; NF-κB

R574

A

1671-9638(2017)10-0893-06

2017-07-13

國家自然科學(xué)基金(No. 81271334、No.81571962)；國家傳染病防治重大科技專項(No. 2012ZX10004501-001-004)

古俊(1992-)，男(漢族)，湖北省襄陽市人，碩士，主要從事天然免疫抗HIV研究。

霍文哲 E-mail：wenzheho@whu.edu.cn

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.10.001