樊琛　紀(jì)秋峰　王會(huì)

摘要：為改善間接ELISA在Iss蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用，將重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、分離，獲得Iss融合蛋白。免疫雛雞獲得抗血清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。采用甲醇處理、紫外線(xiàn)照射、調(diào)節(jié)反應(yīng)物濃度、干燥等方法調(diào)節(jié)間接ELISA反應(yīng)條件。結(jié)果表明，在封閉之前，先將包被板紫外線(xiàn)照射24 h，包被液包被蛋白或細(xì)菌37 ℃ 2 h后4 ℃過(guò)夜，56 ℃干燥 12 h，可改善間接ELISA檢測(cè)結(jié)果。

關(guān)鍵詞：Iss蛋白；抗血清；ELISA檢測(cè)；大腸桿菌；優(yōu)化條件

中圖分類(lèi)號(hào)： TS207文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）14-0150-02

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）通常被稱(chēng)為大腸桿菌，屬于腸道桿菌中的一種，當(dāng)飼養(yǎng)環(huán)境差、通風(fēng)不好、營(yíng)養(yǎng)缺乏或應(yīng)激等情況出現(xiàn)時(shí)會(huì)誘發(fā)畜禽大腸桿菌病，為人獸共患且危害食品安全[1]。Iss蛋白為大腸桿菌毒力島的iss基因（increased serum survival gene）所編碼的外膜蛋白，可增強(qiáng)大腸桿菌在血清中的存活能力，是大腸桿菌的重要毒力因子之一[2]。通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA）檢測(cè)細(xì)菌表面Iss蛋白的表達(dá)水平可能反映細(xì)菌對(duì)血清補(bǔ)體的抗性強(qiáng)弱。ELISA通過(guò)檢測(cè)抗原、抗體及半抗原，在實(shí)際應(yīng)用中可用作疾病臨床診斷與監(jiān)察、食品中有害成分殘留的測(cè)定等，具有廣闊的發(fā)展前景[3-4]。但是ELISA的影響因素較多，須進(jìn)行檢測(cè)條件的摸索、優(yōu)化。為改善間接ELISA在大腸桿菌Iss蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用，將重組菌經(jīng)過(guò)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG）誘導(dǎo)、分離，獲得Iss融合蛋白；免疫雛雞獲得抗血清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)；采用甲醇處理、紫外線(xiàn)照射、調(diào)節(jié)反應(yīng)物濃度、干燥等方法，進(jìn)行ELISA的條件優(yōu)化，為食品中大腸桿菌Iss蛋白的檢測(cè)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來(lái)源

O2為Iss+致病性大腸桿菌，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院贈(zèng)送，聊城大學(xué)食品安全教研室保存；pGEX-6p-1-iss/BL21（DE3）PlysS為重組菌，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院贈(zèng)送，聊城大學(xué)食品安全教研室保存；BL21為感受態(tài)細(xì)菌，購(gòu)自濟(jì)南科賽特科技有限公司。

1.1.2雛雞

1日齡無(wú)特定病原體（specific pathogen free，簡(jiǎn)稱(chēng)SPF）雛雞購(gòu)于山東省聊城市陽(yáng)谷縣養(yǎng)雞場(chǎng)。

1.1.3主要試劑

LB液體培養(yǎng)基、IPTG、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美籃培養(yǎng)基，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；兔抗雞IgY+[KG-*3]+（IgG）（H+L）、四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，簡(jiǎn)稱(chēng)TMB）染色液，均購(gòu)自Beyotime Biotechnology公司；脫脂奶粉，購(gòu)自伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司；其他試劑為分析純。

1.2方法

1.2.1Iss融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)

挑取活化的重組菌落接于含氨芐青霉素（ampicillin，簡(jiǎn)稱(chēng)Amp）50 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)6 h。各取0.2 mL菌液接于20 mL LB液體培養(yǎng)基（體積比 1 ∶[KG-*3]100），37 ℃搖床培養(yǎng)3 h，測(cè)D600 nm值。各取2 mL菌液作誘導(dǎo)前對(duì)照，其他培養(yǎng)物加IPTG（終濃度分別為0.1、0.2、0.5 mmol/L），37 ℃搖床培養(yǎng)3 h，測(cè)D600 nm值[5]。各取2 mL菌液為誘導(dǎo)后樣品，與誘導(dǎo)前樣品均于12 000 r/min離心2～5 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，簡(jiǎn)稱(chēng)PBS）洗滌2次，加入6×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，簡(jiǎn)稱(chēng)SDS）上樣緩沖液，混勻，100 ℃煮沸5～10 min，-20 ℃保存，用于點(diǎn)樣。將誘導(dǎo)后的樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱(chēng)SDS-PAGE），電泳結(jié)束后卸下膠板，切去溴酚藍(lán)條帶，將膠放于考馬斯亮藍(lán)染色液染色1 h，脫色觀察。

1.2.2融合蛋白的純化

將誘導(dǎo)后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后卸下膠板，切去溴酚藍(lán)條帶，將膠放于去離子水中漂洗；再用PBS洗2遍，用0.25 mol/L KCl溶液染色 2～3 min，直至看見(jiàn)清晰條帶；切下來(lái)放于1.5 mL離心管中，稱(chēng)質(zhì)量；-20 ℃凍融，研磨至碎，凝膠與PBS按1 ∶[KG-*3]3的比例，將凝膠融化放于1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心取上清，經(jīng)SDS-PAGE鑒定。按公式計(jì)算蛋白濃度：

1.2.3抗血清的制備

取滅過(guò)菌的2支試管，分別標(biāo)記對(duì)照組、試驗(yàn)組，對(duì)照組加入PBS、弗氏佐劑，試驗(yàn)組加入融合蛋白、弗氏佐劑，乳化[6]。將1日齡SPF雛雞飼養(yǎng)14 d，分為空白、對(duì)照、試驗(yàn)3組，每組10羽?？瞻捉M不作注射，對(duì)照組及試驗(yàn)組每隔1周免疫1次，第4次免疫后5 d取血。首次免疫佐劑為完全弗氏佐劑，第2次到第4次免疫佐劑為不完全弗氏佐劑。

1.2.4間接ELISA檢測(cè)條件的優(yōu)化

在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)間接ELISA檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，具體條件如表1所示。

由圖1可見(jiàn)，IPTG濃度為0.1 mmol/L時(shí)獲得的帶較寬，濃度為0.2、0.5 mmol/L時(shí)也有目的條帶，但獲得的目的條帶比濃度為0.1 mmol/L時(shí)窄。表明IPTG濃度為0.1 mmol/L時(shí)，表達(dá)量最大。因此，選取0.1 mmol/L作為IPTG的誘導(dǎo)濃度。

2.2融合蛋白的純化

經(jīng)切膠純化，取5 μL上清液，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，在約36 ku處有特異條帶（圖2）。

[FK（W13][TPFC22.tif]

由圖2可見(jiàn)，在36 ku處，有符合目的條帶大小的特異條帶，且為單一條帶。表明通過(guò)純化獲得目的蛋白并且無(wú)雜蛋白。通過(guò)吸光度法檢測(cè)在280、260 nm處的吸光值分別為 0.40、0.45，按蛋白濃度（mg/mL）=1.55×D280nm-0.76×D260 nm計(jì)算，得蛋白濃度為0.278 mg/mL。

2.3間接ELISA檢測(cè)的優(yōu)化

經(jīng)96孔板預(yù)處理、包被條件、反應(yīng)物濃度等方面的調(diào)節(jié)，計(jì)算ΔD450 nm=（D450 nm，陽(yáng)性血清-D450 nm，空白）-（D450 nm，陰性血清-D450 nm，空白）。與常規(guī)間接ELISA檢測(cè)ΔD450 nm相比，結(jié)果以?xún)?yōu)化試驗(yàn)組ΔD450 nm與常規(guī)方法組ΔD450 nm之差，即ΔΔD450 nm表示。結(jié)果表明，甲醇處理、洗滌次數(shù)、抗原濃度、一抗?jié)舛取⒍節(jié)舛?、稀釋液種類(lèi)，均對(duì)ΔΔD450 nm值無(wú)明顯影響；紫外線(xiàn)照射包被板24 h、包被后56 ℃干燥12 h，對(duì)ΔΔD450 nm有明顯影響（表2）。

由表2可見(jiàn)，紫外線(xiàn)照射包被板24 h，包被后先56 ℃干燥12 h再封閉，能明顯升高ΔD450 nm差值；改變反應(yīng)物濃度、甲醇處理、PBS稀釋?zhuān)瑢?duì)結(jié)果影響不明顯。

優(yōu)化條件：96孔板紫外線(xiàn)照射24 h，包被液包被蛋白或細(xì)菌37 ℃ 2 h后4℃過(guò)夜，56 ℃干燥12 h，封閉3 h，一抗稀釋100倍，37 ℃溫浴3 h，二抗稀釋1 000倍，37 ℃溫浴 2 h，加入顯色液25 ℃放置1 h。

有研究者認(rèn)為，iss基因編碼的外膜蛋白Iss可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞表面上對(duì)補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合體敏感的位點(diǎn)，導(dǎo)致表面排斥，使菌株具有抗補(bǔ)體溶菌作用的能力，增強(qiáng)E. coli血清抗性[7]。而補(bǔ)體抗性又與毒力高度相關(guān)，是重要的致病因素[8]。多數(shù)研究者認(rèn)為，Iss蛋白是結(jié)合在細(xì)胞表面的[7]，因此，本試驗(yàn)沒(méi)有將菌體裂解而是采用全菌作為抗原包被，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。莊翹楚等在試驗(yàn)中，采用包被抗體、二抗?jié)舛?、改變包被液、改變封閉液、調(diào)節(jié)封閉時(shí)間、調(diào)節(jié)TMB底物作用時(shí)間、改變單一變量進(jìn)行ELISA的條件優(yōu)化。如在包被抗體和二抗工作濃度、封閉液、底物和作用時(shí)間都一致的情況下，采用不同的包被液進(jìn)行包被，以研究不同包被液對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。確定最佳條件：包被抗體1 ∶[KG-*3]1 280、二抗 1 ∶[KG-*3]320、N-溴代琥珀酰亞胺（N-bromobutanimide，簡(jiǎn)稱(chēng)NBS）作為包被液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的BSA-PBS作為封閉液、封閉30 min、顯色30 min[9]。Johnson等對(duì)ELISA檢測(cè)中的常

見(jiàn)問(wèn)題及解決方法進(jìn)行了研究[10]。ELISA檢測(cè)的影響因素較多，如標(biāo)本、試劑、操作等[10]，這些因素導(dǎo)致了ELISA檢測(cè)中的常見(jiàn)問(wèn)題。本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)對(duì)ELISA進(jìn)行條件優(yōu)化，結(jié)果表明，紫外線(xiàn)照射、干燥處理可明顯升高ΔD450 nm。推測(cè)經(jīng)紫外線(xiàn)照射、干燥處理增強(qiáng)了ELISA反應(yīng)中抗原和/或細(xì)菌菌體與包被板的結(jié)合，使ΔD450 nm值升高。

3結(jié)論

優(yōu)化條件為96孔板紫外線(xiàn)照射24 h，包被液包被蛋白或細(xì)菌37 ℃ 2 h后4 ℃過(guò)夜，56 ℃干燥12 h，封閉3 h，一抗稀釋100倍，37 ℃溫浴3 h，二抗稀釋1 000倍，37 ℃溫浴2 h，加入顯色液25 ℃放置1 h，檢測(cè)D450 nm。

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