趙報，程簫，吳炯

海南博鰲瑞達(dá)麥迪賽爾國際醫(yī)療中心有限公司，瓊海 571435

CAR-NK細(xì)胞在腫瘤免疫治療中的研究進(jìn)展

趙報，程簫，吳炯

海南博鰲瑞達(dá)麥迪賽爾國際醫(yī)療中心有限公司，瓊海 571435

趙報，曾任中國科學(xué)院微生物研究所助理研究員，主要研究方向為腫瘤預(yù)防性疫苗和腫瘤治療性疫苗的開發(fā)?，F(xiàn)任海南博鰲瑞達(dá)麥迪賽爾國際醫(yī)療中心有限公司細(xì)胞免疫研發(fā)部負(fù)責(zé)人，主要負(fù)責(zé)DCs、NK、CAR-T/NK腫瘤細(xì)胞免疫治療技術(shù)的開發(fā)。E-mail：zhaobao86@126.com

自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）具有細(xì)胞毒性效應(yīng)，無需抗原預(yù)先致敏，就能自發(fā)殺傷靶細(xì)胞，抵擋惡性腫瘤和病原的入侵，參與免疫監(jiān)視和抗腫瘤應(yīng)答免疫。嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）主要由來源于抗體的單鏈抗體（single-chain variable fragment，scFv）的胞外識別區(qū)和來自于T細(xì)胞抗原受體（TCR）的CD3ζ組成，能特異性地識別腫瘤細(xì)胞表面的 抗原和通過胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)區(qū)域激活淋巴細(xì)胞，增強淋巴細(xì)胞的靶向性和活性，從而殺傷多種腫瘤。目前大多數(shù)的CAR研究都集中在T細(xì)胞，但巨額的花費、額外的毒性等都極大地限制了CAR-T細(xì)胞的廣泛應(yīng)用。CAR-NK細(xì)胞因能提供一種安全、有效的抗腫瘤免疫治療，受到越來越多的重視。主要闡述CAR-NK細(xì)胞在腫瘤免疫治療中的最新研究進(jìn)展，以期為后續(xù)免疫治療研究和NK細(xì)胞研究提供參考。

自然殺傷性細(xì)胞；嵌合抗原受體；腫瘤；免疫治療

腫瘤逐漸成為世界性的主要公共健康問題，在我國，腫瘤已經(jīng)成為心臟疾病外的第二大致死性疾病。目前針對腫瘤的治療手段主要為手術(shù)切除、放療、化療和免疫治療等，而免疫治療受到越來越多的重視。機(jī)體內(nèi)的免疫系統(tǒng)可以分為兩個部分，即天然免疫和獲得性免疫。天然免疫作為機(jī)體的第一道防線，依靠病原識別模式和細(xì)胞機(jī)制消滅外來病原和惡化細(xì)胞。而獲得性免疫，主要由T細(xì)胞和B細(xì)胞組成，通過特異性受體，識別特異性抗原發(fā)揮作用，并能形成記憶性免疫反應(yīng)。傳統(tǒng)上認(rèn)為自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）是天然免疫系統(tǒng)的一部分。早在20世紀(jì)70年代，NK細(xì)胞就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[1-2]，但卻不被認(rèn)為是免疫學(xué)領(lǐng)域的主要研究對象[3]。免疫學(xué)家并沒有認(rèn)識到NK細(xì)胞在機(jī)體免疫系統(tǒng)中的重要性，直到發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞功能缺乏的患者的惡性腫瘤的發(fā)病率高于常人[4-5]，且易受到皰疹病毒的感染[6]，同時發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞活性受損的小鼠體內(nèi)腫瘤的生長速度和轉(zhuǎn)移能力增強[7]，才意識到NK細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的重要性。隨著研究的深入，人類對NK細(xì)胞的認(rèn)識越來越全面。NK細(xì)胞是快速發(fā)揮能力的、高度細(xì)胞毒性的先天免疫效應(yīng)細(xì)胞，對腫瘤和病毒感染的細(xì)胞不需要預(yù)先致敏，因此被稱為“天然”殺手。NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞不受主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）限制，其在腫瘤免疫治療上的優(yōu)勢受到越來越多重視。

1 NK細(xì)胞

1.1 NK細(xì)胞簡述

NK細(xì)胞是約占外周血單個核細(xì)胞的10%左右的、細(xì)胞表面表達(dá)CD3-CD56+表型的大顆粒細(xì)胞，是天然免疫系統(tǒng)中重要的效應(yīng)淋巴細(xì)胞，是人體內(nèi)抵擋病原入侵和惡性腫瘤第一道防線的重要組成之一。NK細(xì)胞發(fā)揮作用是非MHC分子限制性的，其能清除病毒感染的細(xì)胞和癌變的細(xì)胞，無需預(yù)先免疫，而是通過抑制性和激活性信號的動態(tài)平衡實現(xiàn)。與T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞并不表達(dá)抗原受體，其功能的發(fā)揮是通過識別靶細(xì)胞上的配體的種系編碼的受體傳達(dá)的信號。NK細(xì)胞通常被認(rèn)為缺乏T細(xì)胞受體，同時表達(dá)CD16和CD56表面抗原。根據(jù)NK細(xì)胞表面抗原CD56表達(dá)量高低，NK細(xì)胞可分成CD56dim和CD56bright兩個亞群。約90%的NK細(xì)胞為CD56dim亞群，具有較高的細(xì)胞毒性。而另一類CD56bright亞群細(xì)胞毒性弱，可在激活后分泌大量的細(xì)胞因子，多存在于免疫器官中[8-9]。

不同于T細(xì)胞的殺傷作用，NK細(xì)胞的殺傷活性（細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子的分泌）受細(xì)胞表面的抑制性受體和激活性受體的調(diào)控。NK細(xì)胞的抑制性受體，主要是抑制性Ig樣受體（KIRs）和異二聚體C型凝集素受體（NKG2A），可與細(xì)胞表面的MHC I結(jié)合并傳遞抑制信號，從而使NK細(xì)胞進(jìn)入“沉默”狀態(tài)[10]。而NK細(xì)胞的活化是通過其表面的激活性受體（特別是天然細(xì)胞毒性受體NCRs、NKp46、NKp30、NKp44和C型凝集素樣活化免疫受體NKG2D）與細(xì)胞表面的特異性配體結(jié)合，從而通過釋放含有穿孔素和顆粒酶的細(xì)胞質(zhì)顆粒直接殺傷靶細(xì)胞[11]，同時釋放腫瘤壞死因子（TNF）家族的成員（如FasL）和TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL），通過與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)受體的相互作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[11-13]。此外，抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC），通過Fc受體CD16，可觸發(fā)NK細(xì)胞對被抗體結(jié)合的靶細(xì)胞的脫粒作用[14]。

根據(jù)“缺失自我”假設(shè)，NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性是“MHC無限制”，這意味著NK細(xì)胞殺傷的原則是殺死不表達(dá)MHC I類的靶細(xì)胞[15]。當(dāng)成熟的NK細(xì)胞遇到病毒或在惡性轉(zhuǎn)化中出現(xiàn)的缺乏MHC I類的轉(zhuǎn)化細(xì)胞時，NK細(xì)胞表達(dá)的抑制性受體與相應(yīng)配體未接合，抑制性受體的信號的降低和激活性受體的信號的啟動有效激活NK細(xì)胞，進(jìn)而識別并殺傷靶細(xì)胞[16]。同樣的，在病毒或惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)生的細(xì)胞應(yīng)激和DNA損傷可通過激活NK受體而被識別的“應(yīng)激配體”，導(dǎo)致NK細(xì)胞殺死靶細(xì)胞的激活性信號上調(diào)[16-17]。

1.2 NK細(xì)胞治療惡性腫瘤

過去的幾十年中，過繼性轉(zhuǎn)輸體外激活或擴(kuò)增的同種異體NK細(xì)胞已經(jīng)或為腫瘤治療的有效方法。自體或者同種異體的NK細(xì)胞主要來自供體的外周血，但也有來源于骨髓或者臍帶血的。人胚胎干細(xì)胞或者誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞也可能作為NK細(xì)胞的來源。自體NK細(xì)胞聯(lián)合IL-2在臨床上沒有取得良好的臨床效果，可能是因為IL-2相關(guān)的副作用，以及IL-2激活的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制NK細(xì)胞的功能或引起激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡；其次，自身的人類白細(xì)胞抗原（HLA）也能通過殺傷型免疫球蛋白樣受體（KIR）抑制NK細(xì)胞的功能。而同種異體的NK細(xì)胞由于“缺失自我”的機(jī)制，比自體NK細(xì)胞發(fā)揮更好的活性。Miller等[18]通過回輸體外擴(kuò)增的半相合NK細(xì)胞進(jìn)行腫瘤治療，證明體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞是安全的，不會引起移植物抗宿主排斥反應(yīng)（GVHD），I期臨床試驗共招募了43位血液類腫瘤或者實體瘤患者，在接受NK細(xì)胞治療和相應(yīng)的輔助治療后，19位急性骨髓性白血病（AML）患者中有5位獲得完全緩解。研究表明瘤內(nèi)NK細(xì)胞和腫瘤進(jìn)展延遲與良好預(yù)后具有相關(guān)性。不過，應(yīng)用NK細(xì)胞進(jìn)行實體腫瘤的治療具有一些困難，除了分泌抑制性細(xì)胞因子和下調(diào)激活配體等免疫逃逸機(jī)制外，NK細(xì)胞必須要遷移到實體腫瘤部位并浸潤到腫瘤內(nèi)部發(fā)揮作用；其次，腫瘤靶標(biāo)抗原需對NK介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性敏感。已經(jīng)開展的一部分針對復(fù)發(fā)性實體腫瘤的臨床可行性研究，多采用體外擴(kuò)增的自體或異體NK細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，但是目前針對于實體瘤進(jìn)行NK細(xì)胞治療的有效性研究的報道很少[19]。

2 CAR-NK細(xì)胞簡述

在過去的20多年中，嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）修飾T細(xì)胞的研究快速發(fā)展。如抗CD19 CAR-T細(xì)胞治療在2014年被美國食品和藥物管理局（FDA）授予“突破療 法”稱號[20-21]。2017年7月12日，F(xiàn)DA腫瘤藥物專家咨詢委員會就諾華CAR-T產(chǎn)品tisagenlecleucel（CTL-019）的生物制品許可申請（BLA）進(jìn)行了討論和投票表決，最終以10∶0的結(jié)果支持批準(zhǔn)CTL-019上市。目前CAR-T細(xì)胞治療已經(jīng)成為有前途的免疫治療策略，被廣泛用于慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）和急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）[22-26]，具有驚人的臨床效果，并獲得了學(xué)術(shù)界和工業(yè)界研究人員的重視[27]。最為成功的是，在采用CAR-T細(xì)胞治療ALL中，有幾組的痊愈率高達(dá)90%。然而，CAR修飾的T細(xì)胞具有許多局限性。讓病人提供自體CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品所需的T細(xì)胞不僅會對病人造成負(fù)擔(dān)，而且在臨床使用中也具有很大的局限性。同時，CAR-T細(xì)胞的制備通常需要數(shù)周之久，這對于治療病情迅速發(fā)展的病人顯得不切實際。而且，并不總能從大量預(yù)處理中收集到符合臨床所需的足夠的T淋巴細(xì)胞。雖然同種異體T細(xì)胞可以克服以上這些臨床挑戰(zhàn)，然而，即使同種異體T細(xì)胞的HLA相匹配，仍會存在由于其自身T細(xì)胞受體（TCR）造成GVHD的極大風(fēng)險。

與T細(xì)胞相比，NK 細(xì)胞應(yīng)用于腫瘤免疫治療有很多優(yōu)勢。首先，NK細(xì)胞是抗原非特異性的，不需要MHC特殊抗原的表達(dá)，就可識別一系列可誘發(fā)細(xì)胞溶解的配體；其次，過繼性轉(zhuǎn)輸自體或者同種異體的NK 細(xì)胞在體內(nèi)的持續(xù)時間較短，一般只有幾天或幾周，所以一些危害生命的毒性［如細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）］幾乎不可能發(fā)生。此外，T細(xì)胞可能引起GVHD，而NK細(xì)胞則不會，因為供體NK細(xì)胞通常不會攻擊非造血組織，如肝、肺、腎和肌肉。同時，NK細(xì)胞在人體內(nèi)存活期較短，也可以緩解GVHD發(fā)展的風(fēng)險[28]。此外，NK細(xì)胞的功能受抑制性受體嚴(yán)格控制，如KIR和其他抑制性受體[7]。NK細(xì)胞獨特的細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)特征可能就是在轉(zhuǎn)輸NK細(xì)胞時副作用較輕的原因所在。

對免疫細(xì)胞進(jìn)行修飾從而特異性地靶向殺傷腫瘤細(xì)胞是一種戰(zhàn)勝腫瘤逃逸機(jī)制非常有效的方法。CAR使免疫細(xì)胞可以以不受MHC限制的方式識別腫瘤表面抗原，增強免疫細(xì)胞的靶向性。CAR是由胞外抗原識別區(qū)［主要為抗體的單鏈抗體片段（scFv）、自然配體和抗體的抗原結(jié)合片段（Fab）等］、連接子、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組成，它能使淋巴細(xì)胞識別腫瘤細(xì)胞表面特異性的抗原，同時激活淋巴細(xì)胞，從而靶向殺傷腫瘤細(xì)胞[29]。自1989年第一代CAR的誕生，CAR結(jié)構(gòu)目前已發(fā)展到共表達(dá)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)基因的第四代。第一代CAR主要為scFv、連接子、跨膜區(qū)胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域（CD3ζ），第二代CAR在第一代CAR的基礎(chǔ)上添加了共刺激信號結(jié)構(gòu)域（4-1BB或CD28），第三代CAR在第二代 CAR 的基礎(chǔ)上，同時表達(dá)兩個共刺激信號結(jié)構(gòu)域（4-1BB和CD28），理論上第三代CAR的持續(xù)時間要長于第二代CAR。因其良好的靶向性、殺傷性和持續(xù)性，目前CAR技術(shù)已被廣泛用于T細(xì)胞，并在白血病和淋巴惡性腫瘤的臨床試驗中顯示出良好的效果[30-34]。

3 CAR-NK細(xì)胞治療惡性腫瘤

3.1 CAR-NK細(xì)胞治療急性淋巴細(xì)胞白血病

利用細(xì)胞表面不同抗原修飾的CAR-NK細(xì)胞廣泛應(yīng)用于治療白血病。CD5在T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病（T-ALL）和T細(xì)胞淋巴瘤中高度表達(dá)，根據(jù)CD5分子進(jìn)行修飾的CD5-CAR-NK92細(xì)胞可以殺死多種T細(xì)胞白血病和淋巴瘤細(xì)胞系[35]。CD19-CAR修飾的NK細(xì)胞殺傷功能明顯增強（細(xì)胞毒性作用的增強及細(xì)胞因子分泌的增多），可用于治療原發(fā)性CLL[36]、AML、ALL[23，32]、骨髓增生異常綜合征（MDS）[37]和B細(xì)胞白血病[38-39]。CD20-CAR-NK92細(xì)胞對原代CLL細(xì)胞的細(xì)胞毒性強于結(jié)合抗CD20的單抗且表達(dá)IgG Fcγ受體III（FcγR III也稱為CD16）的NK92細(xì)胞[36]。

3.2 CAR-NK細(xì)胞治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤

眾所周知，CAR修飾的T細(xì)胞正面臨靶向治療實體腫瘤的挑戰(zhàn)[40]，CAR-NK細(xì)胞的研究必須克服類似的障礙。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤由于其高侵襲性和易轉(zhuǎn)移性，是致死性原發(fā)性惡性腫瘤之一[41]。神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，是兒童最常見的顱外實體瘤[42]。NK92細(xì)胞已被開發(fā)用于體外治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤。研究表明，利用ErbB2（起源于與禽類骨髓紅細(xì)胞增多癥病毒有關(guān)的ERB-B基因）-CAR[43]或EGFR（表皮生長因子受體）-CAR[44]修飾NK92細(xì)胞可治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，GD2（二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂）-CAR-NK92細(xì)胞則被用于治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤[45]，均取得較好的療效。

3.3 CAR-NK細(xì)胞治療乳腺癌

乳腺癌是女性最常見的癌癥。使用CAR修飾的NK92細(xì)胞廣泛用于乳腺癌免疫治療，將為廣大乳腺癌患者帶來希望。大量研究表明，用抗人表皮生長因子受體2（HER2）-CAR（CD28-CD3ζ）修飾的NK細(xì)胞和NK92細(xì)胞株均表現(xiàn)出特定的抗腫瘤活性，能夠特異性識別且高效殺傷 HER2+的腫瘤細(xì)胞[46-47]。而EGFR-CAR-NK92細(xì)胞系配合溶瘤性單純皰疹病毒1（oHSV-1）將有希望治療癌細(xì)胞已轉(zhuǎn)移至大腦的EGFR陽性乳腺癌[48]。

3.4 CAR-NK細(xì)胞治療多發(fā)性骨髓瘤

多發(fā)性骨髓瘤是在B淋巴細(xì)胞分化成漿細(xì)胞的過程中發(fā)生的遺傳突變導(dǎo)致的惡性腫瘤[49]。多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中常見的腫瘤抗原有CS1、CD138、BCMA等。目前，大量CAR-T細(xì)胞被開發(fā)用于治療多發(fā)性骨髓瘤[50-51]。然而，很少有研究報道采用CAR-NK細(xì)胞治療多發(fā)性骨髓瘤。目前用于治療多發(fā)性骨髓瘤的CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)品多采用NK92細(xì)胞系，所采用的腫瘤抗原多為CS1和CD138。細(xì)胞表面糖蛋白CD2子集1（CS1，也稱為CRACC、SLAMF7、CD319或19A24）是多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)的蛋白質(zhì)，多參與骨髓瘤細(xì)胞黏附和生長[52]。CD138，也稱為類肝素樣硫酸蛋白多糖，參與骨髓瘤細(xì)胞的黏附、生長和成熟，是多發(fā)性骨髓瘤主要的診斷標(biāo)記[53]。分別利用CS1和CD138為靶點設(shè)計的CS1-CAR-NK92細(xì)胞和CD138-IFNα-CARNK92細(xì)胞成功抑制多發(fā)性骨髓瘤生長，延長了骨髓瘤小鼠的存活期[54-55]。

4 結(jié) 語

雖然目前針對NK/CAR-NK展開的研究取得了很好的結(jié)果，但也面臨一些問題。一是NK細(xì)胞來源的問題。目前開展研究采用的NK細(xì)胞主要來自于自體或者同源異體外周血的NK細(xì)胞和NK細(xì)胞系。NK細(xì)胞系（如NK-92）是體外擴(kuò)增培養(yǎng)經(jīng)輻射后回輸給患者使用，存在一定的安全隱患。而自體NK細(xì)胞經(jīng)證實療效受限，目前開展NK細(xì)胞免疫治療多采用半相合的或同種異體NK細(xì)胞，沒有觀測到安全問題。因此可以通過建立同種異體NK細(xì)胞庫來解決細(xì)胞制備周期長的問題。二是NK細(xì)胞快速大量擴(kuò)增問題。目前NK細(xì)胞快速大量擴(kuò)增多采用表達(dá)4-1BB配體和IL-21的K562飼養(yǎng)細(xì)胞體系，NK細(xì)胞的安全性需要進(jìn)一步驗證，因此開發(fā)無飼養(yǎng)細(xì)胞、無血清快速大量擴(kuò)增NK細(xì)胞是十分必要的。三是構(gòu)建CAR-NK細(xì)胞多采用病毒載體的轉(zhuǎn)染方式，而NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率低，影響CAR-NK細(xì)胞的治療效果，可以開發(fā)新的轉(zhuǎn)染方式，如電轉(zhuǎn)染或者優(yōu)化條件來提高轉(zhuǎn)染效率。未來幾年內(nèi)可能會提供CAR-NK細(xì)胞臨床試驗數(shù)據(jù)從而證明其治療的有效性，并且可能會因此改變腫瘤免疫治療的格局。為了進(jìn)一步提高腫瘤免疫治療效果，可以采用聯(lián)合治療的手段，通過改變NK細(xì)胞本身來提高其有效性，如抑制或敲除免疫檢驗點分子或者改變腫瘤微環(huán)境，通過CRISPR/Cas9技術(shù)或者單克隆抗體清除抑制性信號（anti-KIR 或anti-TIGIT）等。

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Research progress of chimeric antigen receptor engineered natural killer cells in tumor immunotherapy

ZHAO Bao，CHENG Xiao，WU Jiong
Hainan Boao Ruida Medicell International Medical Center Co., Ltd., Qionghai 571435, China

Natural killer（NK）cells are highly cytotoxic immune effectors, and contribute to the body’s immune defenses, which play important roles in the rejection of tumors and cells infected by viruses, without prior sensitization. NK cells can also participate in immune surveillance and anti-tumor immune responses. Chimeric antigen receptor（CAR）,which is composed of an extracellular antigen-binding domain, typically the single-chain variable fragment（scFv）derived from a monoclonal antibody, and an intracellular signaling domain, usually the CD3ζ chain of the T cell receptor（TCR）, can enhance lymphocyte targeting and activation to diverse malignancies. The majority of CAR studies hav e focused on T cells, however, cost, additional toxicity and other disadvantages have limited its widespread use. CAR-NK cells are getting more and more attention because they provide a safe and effective immunotherapy. This paper aims to summarize some of promising advances in CAR-NK cells, which promise to enhance and widen the research of tumor immunotherapy and NK cells therapy in the future.

natural killer cells; chimeric antigen receptor; tumor; immunotherapy

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.05.007