梅義，楊思鳴，白仲虎，戴曉峰

1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，無錫 214122 2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無錫 214122

過繼T細(xì)胞免疫治療的工業(yè)研究進展與展望

梅義1，2，楊思鳴1，2，白仲虎1，2，戴曉峰1，2

1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，無錫 214122 2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無錫 214122

戴曉峰，江南大學(xué)生物工程學(xué)院、糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向主要集中在乳腺癌基礎(chǔ)研究、生物信息及相關(guān)學(xué)科交叉研究。發(fā)表SCI文章17篇（第一作者兼/或通訊作者），影響因子之和57.215。2016年入選“江蘇省六大人才高峰高層次”人才支持計劃，2015年獲得“無錫市社會事業(yè)領(lǐng)軍人才”稱號。E-mail：xiaofeng.dai@jiangnan.edu.cn

隨著商業(yè)化過繼T細(xì)胞免疫治療產(chǎn)品在臨床治療中取得成功，過繼T細(xì)胞免疫治療已經(jīng)成為一種治療復(fù)雜疾病的新方法。但是實現(xiàn)T細(xì)胞產(chǎn)業(yè)化并使其成為多種疾病的可靠、安全、有效的治療方法仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。對過繼T細(xì)胞免疫治療的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)所面臨的問題進行了探討并提出了相關(guān)意見。

過繼T細(xì)胞免疫治療；臨床操作；工業(yè)生產(chǎn)

1 發(fā)展歷程

過繼T細(xì)胞免疫治療（ACT療法）是通過收集并改造患者自身的免疫細(xì)胞后將其重新注入病人體內(nèi)達(dá)到治療效果的方法，目前被認(rèn)為是癌癥和病毒感染患者高度有效的免疫治療手段[1]。臨床證明，培養(yǎng)與注射自體腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞達(dá)到了治療效果[2-4]。也有報道稱T淋巴細(xì)胞經(jīng)過基因修飾調(diào)節(jié)后可使癌細(xì)胞死亡[5]，如急性淋巴細(xì)胞白血病中特異性靶向CD19分子的嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞有著顯著的治療效果[6-7]，又如腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）特異性改造后對黑色素瘤患者同樣有著顯著的治療效果[8-9]。這些有意義的結(jié)果促使了美國FDA批準(zhǔn)了大量新藥物的開發(fā)研究[10-11]。

ACT療法在制藥行業(yè)引起了極大的關(guān)注，目前已有幾家公司在該領(lǐng)域表現(xiàn)十分突出。Lion Biotechnologies是一家致力于商業(yè)化研發(fā)TIL的新型癌癥免疫療法的美國公司，已獲得美國國家癌癥研究所許可協(xié)議，開發(fā)用于治療IV期轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的TIL。英 國生物技術(shù)公司Adaptimmune是一家專注于T細(xì)胞受體研發(fā)的公司，其在美國的幾個醫(yī)療中心進行了9例第一階段的T細(xì)胞治療試驗。瑞士制藥企業(yè)Novartis與賓夕法尼亞大學(xué)開展全球獨家性合作，合作開發(fā)了一種新型CAR-T細(xì)胞治療藥物CTL019，并建立了臨床試驗，該試驗可能在2017年被美國FDA批準(zhǔn)。Juno Therapeutics是一家基于CAR和T細(xì)胞受體（TCR）的免疫治療公司，公布了其CAR-T治療藥物JCAR015在急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）治療中的臨床數(shù)據(jù)。Kite Pharma是一家專注于ACT療法研發(fā)的生物科技公司，已經(jīng)與美國國家癌癥研究所簽署協(xié)議，開發(fā)商業(yè)化TCR和CAR醫(yī)療藥物。2015年報道了其CAR-T產(chǎn)品KTE-C19-101（ZUMA-1）關(guān)于急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者在第一和第二階段臨床試驗的成功，該產(chǎn)品在NHL患者的第二階段臨床試驗中已被美國FDA授予突破性療法認(rèn)定。日本公司Ono Pharmaceutical已經(jīng)與美國公司Celyad簽署了許可協(xié)議，在日本和韓國規(guī)?；_發(fā)和商業(yè)化生產(chǎn)NKG2D配體靶向同種異體CAR-T細(xì)胞治療藥物NKR-2。

ACT療法不僅在發(fā)達(dá)國家快速發(fā)展，也在中國等發(fā)展中國家快速發(fā)展。以2014年在美國納斯達(dá)克證券交易所上市的西比曼生物科技公司（CBMG）為例，CBMG與中國人民解放軍總醫(yī)院就其CAR-T的臨床試驗建立了戰(zhàn)略合作關(guān)系，并于2014年公布了臨床試驗結(jié)果（NCT01735604）。該結(jié)果顯示了CD20、CD137和CD3ζ衍生部分共同使用對晚期彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）患者有顯著療效[12]。在入選的7例患者中，4例被診斷為腫瘤負(fù)荷可作為有效指標(biāo)用于臨床療效的評估，3例顯示在3～6個月后腫瘤明顯消退，治療效率達(dá)到75%[12]。這些結(jié)果首次表明，抗CD20 CAR-T細(xì)胞與減壓調(diào)理方案相結(jié)合可能會使晚期DLBCL的腫瘤消退。2015年，他們又公布了一項臨床結(jié)果（NCT01864889），該試驗使用T細(xì)胞經(jīng)過修改后表達(dá)B細(xì)胞靶向抗原CD19、4-1BB和CD3ζ衍生部分，用于治療復(fù)發(fā)或化療難治性B-ALL患者[13]。18周后，9例患者（6例患有B-ALL髓外受累、3例患有B-ALL）的總體存活率達(dá)到56%。值得注意的是，7例未接受輔助化療的患者中有4例在造血系統(tǒng)和髓外組織處病情得到明顯緩解。這些結(jié)果證明抗CD19 CAR-T細(xì)胞治療髓外B-ALL有顯著的緩解效果[13]。最近，CBMG的親密合作者Han博士發(fā)表了他們的I期臨床試驗結(jié)果，用CAR-CD30 T細(xì)胞治療18例復(fù)發(fā)性或難治性霍奇金淋巴瘤（HL）患者，顯示了CAR-CD30在控制頑固性淋巴瘤病情上的安全性、可行性與療效性[14]。

近年來，ACT療法在治療癌癥和傳染病方面的重要地位得到了學(xué)術(shù)研究人員和制藥公司的廣泛認(rèn)可。如上所述，幾個產(chǎn)品的臨床試驗和商業(yè)化生產(chǎn)正在進行中。然而，鑒于免疫反應(yīng)的復(fù)雜性和不可預(yù)測的信號級聯(lián)放大產(chǎn)生的潛在危險性，該療法的異質(zhì)性和特異性要求，以及對基礎(chǔ)設(shè)施和個人生產(chǎn)技能的高要求，使其難以在沒有持續(xù)研發(fā)以及標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)流程的情況下產(chǎn)生一致和理想的臨床結(jié)果。

2 原 理

ACT療法通過募集自身的T細(xì)胞來利用免疫系統(tǒng)對外來入侵進行識別并組織進攻。具有這樣的臨床特征的T細(xì)胞主要有3種：①在體外進行分離、活化和擴增的TIL；②通過外周血T淋巴細(xì)胞改造成TCR或特異性識別腫瘤的CAR；③病毒特異性T細(xì)胞。保證ACT療法成功的關(guān)鍵是避免患者的免疫系統(tǒng)對重新輸入體內(nèi)的T細(xì)胞進行免疫抑制應(yīng)答。因此，常規(guī)方法是在回輸之前對患者進行輔助化學(xué)療法或放射療法，消耗其內(nèi)在免疫細(xì)胞以便體外注入的T細(xì)胞在體內(nèi)進行繁殖擴增[2]。

注射體外擴增的TIL已被證明可治療頑固性黑色素瘤[8-9]。具有靶向癌細(xì)胞的T細(xì)胞一般難以收集檢測，但是在黑色素瘤中這些細(xì)胞能夠輕易地被切片檢測。近30年來，TIL治療已經(jīng)被證明可以緩解甚至消除黑色素瘤[15-17]?，F(xiàn)在體外TIL擴增的標(biāo)準(zhǔn)流程方案已經(jīng)確立，包括個體細(xì)胞的培養(yǎng)、擴增、收集、洗滌、配制和冷凍保存。然而，這種方案的缺點是多種細(xì)胞的培養(yǎng)以及特異性腫瘤識別檢測時耗時長并且價格昂貴，因此出現(xiàn)了“簡化版”TIL培養(yǎng)模式，這種模式的優(yōu)點是培養(yǎng)大量淋巴細(xì)胞而不是個體細(xì)胞微量培養(yǎng)，同時省去了腫瘤識別篩選步驟。

雖然TIL在治療黑色素瘤方面取得成功，但是由于腫瘤特異性T細(xì)胞難以收集，同樣的方法應(yīng)用到其他癌癥顯然行不通[9]。通過遺傳修飾使外周血淋巴細(xì)胞具有抗腫瘤活性是理想的治療方案，即常用的TCR和CAR-T治療方案。如NY-ESO-1 TCR[18-19]與CD19-CAR T細(xì)胞[6，20-21]都已取得令人滿意的治療效果。TCR治療是通過病毒載體給予T細(xì)胞新的受體，使其特異性識別癌癥抗原，提高識別與結(jié)合目標(biāo)的能力。通過患者腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞[22]、人源小鼠模型[23-24]或使用噬菌體展示技術(shù)[25]達(dá)到克隆擴增TCR的目的。目前，TCR療法已證實可以減緩甚至消除黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌和滑膜肉瘤中的腫瘤[19，26]。不過這一切的前提是TCR必須與患者的免疫系統(tǒng)相適應(yīng)。

CAR是重組抗原受體，主要由3部分組成，分別是特異性識別癌抗原的受體部分、激活細(xì)胞應(yīng)答的受體部分以及維持T細(xì)胞活性和快速增殖的刺激因子[2]。通過遺傳修飾將其導(dǎo)入T細(xì)胞后，使得改造后的T細(xì)胞具有特異性靶向作用、免疫應(yīng)答機制以及快速擴增的特點[3-4]。CAR特異性識別腫瘤是由一段可變單鏈片段決定的，該可變單鏈片段來源于單克隆抗體或者人源化Fab[27]。一旦表面受體與抗原作用，CAR就會開啟攻擊模式，因此CAR在T細(xì)胞中穩(wěn)定持續(xù)的表達(dá)至關(guān)重要，同時這也會影響下游信號傳導(dǎo)的強度和表達(dá)質(zhì)量，從而確定CAR修飾的T細(xì)胞的功效性和安全性。理論上，任何細(xì)胞表面分子都可以通過CAR-T方法添加表面抗原識別受體來達(dá)到靶向作用[27]。雖然CAR局限于細(xì)胞表面抗原的識別，但是由于其靈活性和可操作性而普遍被大家所接受。此外，CAR不需要經(jīng)歷抗原加工和呈遞的過程，可廣泛地適用于人類白細(xì)胞抗原（HLA）臨床樣組。曾有報道，CAR-T細(xì)胞靶向CD19使晚期慢性淋巴細(xì)胞性白血?。–LL）患者以及多次化療失敗患者的腫瘤狀態(tài)得到緩解[6-7]。

病毒抗原特異性T細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為病毒感染和病毒相關(guān)惡性腫瘤的一項標(biāo)準(zhǔn)治療措施，具有完善的生產(chǎn)流程。已有使用單核細(xì)胞和EB病毒（EBV）轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞形成的特異性T細(xì)胞對EBV、巨細(xì)胞病毒（CMV）和腺病毒（AdV）特異反應(yīng)的成功報道[28]。另有報道指出，已生產(chǎn)出對CMV，AdV，EBV，BK病毒（BK）和人類皰疹病毒6（HHP6）這5種病毒有共同特異性的T細(xì)胞，大大降低了生產(chǎn)難度，縮短了生產(chǎn)時間[1]。

3 加強研發(fā)

工程化T細(xì)胞在不同的共刺激分子的作用下，可能發(fā)揮不同的作用，對某些癌癥的療效也可能比其他治療方法更好，這一觀點已被大眾所接受。ACT療法的特點在于平衡免疫系統(tǒng)的各個組成部分，以達(dá)到理想的臨床效果，這為醫(yī)學(xué)界帶來了一種劑量概念化的新方法。因此，為了能夠優(yōu)化治療方案，根據(jù)不同案例具體分析，使每種類型的惡性腫瘤甚至每個患者都達(dá)到最佳治療效果，就需要不斷地深入研發(fā)。

ACT療法的局限在于通過識別癌細(xì)胞表面抗原達(dá)到靶向治療效果的同時不與自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生反應(yīng)[29]。但實際上很多癌細(xì)胞中的抗原同樣在正常組織中存在。如用于乳腺癌治療的靶標(biāo)HER2也在心臟細(xì)胞表面表達(dá)。使用低特異性靶向抗原可能導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，在TCR工程化T細(xì)胞的臨床試驗中，美國國家癌癥研究所的研究人員發(fā)現(xiàn)，9例患者中有2例在以MAGE-A3為靶標(biāo)后出現(xiàn)了昏迷狀況并致死亡，事后發(fā)現(xiàn)MAGE-A3在腦組織中低水平表達(dá)[2]。Adaptimmune已經(jīng)率先實施了安全測試技術(shù)，以防止意外的發(fā)生。同時，尋找有效的靶向生物標(biāo)志物也變得越來越重要[29]。為了解決這個問題，需要進一步深入研究以確定新的候選標(biāo)志物，并需要了解每一個候選標(biāo)志物在全身各處的表達(dá)機制，以改善ACT療法使其獲得更好的療效。

若想達(dá)到良好的治療效果就需要有足夠量的T細(xì)胞被注入患者體內(nèi)。然而，改造后的CAR-T細(xì)胞會一直存留患者體內(nèi)造成很多的副作用，甚至觸發(fā)生命危險。如一名直腸癌患者在CAR-T治療后引發(fā)了一種被稱為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的不受控制的免疫反應(yīng)使其死亡。另外，一種由CAR-T細(xì)胞引起的免疫雪崩現(xiàn)象也容易引起腫瘤溶解綜合征，其后果是大量的腫瘤死亡后的碎片組織進入血液循環(huán)系統(tǒng)，造成更深層次的隱患。ACT療法的安全問題引起了廣泛關(guān)注，專家們已提出了幾種控制ACT療法的副作用的有效策略，并已經(jīng)取得臨床試驗的成功，如“自殺基因的設(shè)計”[30]和“靶向雙重腫瘤抗原”[31]。盡管有這些策略的提出，仍需要進一步深入研究才能確保ACT療法成為一項既強大又安全的治療方法。

在進行ACT治療前，需要抑制患者的內(nèi)源性免疫應(yīng)答，確保注入體內(nèi)的T細(xì)胞能夠增殖擴散。為了達(dá)到更好的效果，通常會給CAR-T細(xì)胞修飾上共刺激結(jié)構(gòu)域，以增強其增殖能力，強化免疫應(yīng)答的效果。但是這種改造使得發(fā)生不可控副作用的可能性隨之大增[32]。因此，為了在減少副作用的同時又盡可能地發(fā)揮各種治療效果，還需要不斷深入的研究來推進CAR的設(shè)計，提高工程T細(xì)胞的穩(wěn)定性。

雖然CAR-T細(xì)胞可以在患者體內(nèi)長時間存留使其有著預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的功能[33]，但是不可避免地引起了骨髓抑制和肝毒性問題。Han等[34]報道了在臨床病例研究中的白血病患者接受靶向CD33的CAR-T治療后，在后期骨髓中的CD33+白血病細(xì)胞反而逐漸增多出現(xiàn)病情惡化。這警醒著人們必須進行深入研究，進一步根據(jù)每個病人的情況調(diào)整CAR-T產(chǎn)品的有效藥物作用時間。

最令人期待的是ACT在實體腫瘤治療中的效果。盡管T細(xì)胞有靶向癌細(xì)胞的功能，但仍需到達(dá)腫瘤部位才能起作用。許多臨床實例證明對于白血病來說，運輸并不是問題，但對于實體腫瘤的治療，運輸是一道瓶頸[35]?，F(xiàn)已表明，將趨化因子受體引入CAR-T細(xì)胞可以提高其運輸擴散能力[35-37]。最新研究證實了使用CAR-T混合免疫療法對于治療膽管癌的可行性[38]，該方法使用了EGFR（表皮生長因子受體）特異性和CD133特異性嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞。2017年同時啟動了一項涉及23例轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌患者的I期臨床試驗，以測試CAR-T產(chǎn)品靶向腫瘤相關(guān)糖蛋白TAG-72卷曲CD3ζ細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域的功效性和安全性。結(jié)果顯示，CAR-T細(xì)胞成功運輸至腫瘤部位并降低了TAG-72表達(dá)，盡管沒有明確的啟動/關(guān)閉腫瘤毒性的證據(jù)，但出現(xiàn)了抗CAR免疫反應(yīng)癥狀[39]。相關(guān)專家現(xiàn)已提出一些特定類型的免疫細(xì)胞，如γδT細(xì)胞，將有希望用于靶向腫瘤的細(xì)胞治療[40]。這些成果令人鼓舞，但目前人們對于免疫細(xì)胞趨化性和遷移的機制仍然知之甚少。因此需要在這一領(lǐng)域繼續(xù)深入研究，以期進一步完善治療體系。

4 標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)規(guī)范

生產(chǎn)基因工程化T細(xì)胞是一個復(fù)雜的過程。首先需要收集患者富含T細(xì)胞的外周血單核細(xì)胞（PBMC）并將其激活，再進行基因修飾，擴增達(dá)到臨床所需的細(xì)胞數(shù)量，并在注入體內(nèi)前進行活化培養(yǎng)或冷凍保存（圖1）。該產(chǎn)品必須經(jīng)過多項質(zhì)量監(jiān)控檢測，達(dá)到生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）的要求。

個性化先進治療藥物（ATMP）的生產(chǎn)同樣復(fù)雜。首先，細(xì)胞制造過程工作強度大，需要訓(xùn)練有素的操作員進行操作。其次，必須具備無菌環(huán)境并配備足夠的設(shè)施與工具。對人力技能、衛(wèi)生條件和基礎(chǔ)設(shè)施的高要求一方面導(dǎo)致ACT療法失敗率高，另一方面使得全世界只有少數(shù)機構(gòu)具有相應(yīng)的生產(chǎn)能力。

4.1 生產(chǎn)流程

為了使T細(xì)胞療法更有效地服務(wù)大眾，非常有必要對其制造過程進行優(yōu)化：①生產(chǎn)安全且有效的細(xì)胞產(chǎn)品；②細(xì)胞可增殖且持續(xù)有效。為實現(xiàn)這些目標(biāo)，筆者提出了一些建議。

一是使用封閉系統(tǒng)。細(xì)胞制備過程中的每個操作都可能會導(dǎo)致細(xì)胞污染。為保持無菌環(huán)境，可使用封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)，在封閉的管道通路中生產(chǎn)細(xì)胞[42]。為保證產(chǎn)品的安全性、有效性以及生產(chǎn)的成本效益，整個封閉系統(tǒng)至少要保證在環(huán)境等級10000（ISO 7）及以上的體系中生產(chǎn)運行。多種符合GMP要求的培養(yǎng)袋、管道配件、連接器以及無菌管道焊接共同組成封閉系統(tǒng)。

圖1 基因工程T細(xì)胞生產(chǎn)的經(jīng)典工作流程[41]

二是使用自動化操作系統(tǒng)。標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的最佳方式是使其自動化，目前市場上有許多設(shè)備可供選擇。在細(xì)胞篩選過程中，流式細(xì)胞儀是一個典型代表，但是其需要對樣品、試劑、儀器、數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理和設(shè)置[43]。AutoMACS?分離器（Miltenyi Biotec公司）提供了一種自動化生產(chǎn)方案[44]［圖2（a）］，其可以直接從全血或骨髓中分離細(xì)胞，同時省去了紅細(xì)胞裂解和密度梯度離心步驟。Tecan公司與Miltenyi Biotec公司合作，開發(fā)了全自動多樣品池隔離工作站，將包括autoMACS?分離器和相關(guān)軟件在內(nèi)的設(shè)備集成到Tecan FreedomEVO?自動化液體處理站［圖2（b）］。當(dāng)然，在細(xì)胞篩選過程中還有其他的設(shè)備選擇，如Biosafe Sepax?（Biosafe Group公司）[45]［圖2（c）］，Elutra?（Terumo公司）[46]［ 圖2（d）］以 及CliniMACS?Plus儀 器（Miltenyi Biotec公司）[47]［圖2（e）］。DynMag?CTS?（Life Technologies公司）［圖2（f）］提供了一種理想的密閉無菌系統(tǒng)，其設(shè)備使用培養(yǎng)袋和DynaMag磁體技術(shù)[42]進行細(xì)胞的“隔離”、“激活”和“級聯(lián)放大”步驟。還有幾個設(shè)備也可用于自動化“級聯(lián)放大”步驟。GE Healthcare Life Sciences公司開發(fā)了XuriTM細(xì)胞擴增系統(tǒng)［圖2（g）］，其允許細(xì)胞在連接到放置在搖擺平臺上的氣體控制單元的培養(yǎng)袋中培養(yǎng)擴增并且能夠保持所需溫度[48]。同時還設(shè)計了WAVE bioreactorTM（GE Healthcare Life Sciences公司）[49]［圖2（h）］用于大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞。G-Rex?技術(shù)（Wilson Wolf公司）［圖2（i）］支持錐形瓶在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)出高密度的細(xì)胞[50-51]。G-Rex?比XuriTM更好之處在于其能在實現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)聯(lián)級放大的同時使用泵來控制補料[52-53]，然而缺陷是細(xì)胞接種期間需要打開瓶口，不能保證百分百的密閉無菌環(huán)境。在“培養(yǎng)”步驟中，Biosafe Group公司推出的Se fi a平臺［圖2（j）］展示了最先進的多功能封閉系統(tǒng)，通過結(jié)合連續(xù)流離心、溫度調(diào)節(jié)、8個獨立的流體路徑和智能過程控制，可以按照專門的操作標(biāo)準(zhǔn)“FlexCell”，以快速和全自動的方式實現(xiàn)純化、濃縮、洗滌，最終培養(yǎng)出大量細(xì)胞。此外，COBE?2991（Gambro BCT公司）［圖2（k）］是一款被廣泛認(rèn)可的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其減少了對潔凈室設(shè)施的需求[54]。CliniMACS Prodigy?（Miltenyi Biotec公司）［圖2（l）］提供了一款可以完成從細(xì)胞制備、選擇、活化、擴增、轉(zhuǎn)導(dǎo)到培養(yǎng)整個流程的自動化設(shè)備[55]，目前已被用于臨床干細(xì)胞富集和病毒反應(yīng)性T細(xì)胞制備[56-58]，隨后被改造用于T細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)以及CAR-T細(xì)胞的自動化培養(yǎng)[59]。

圖2 免疫治療設(shè)備舉例

三是商業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟化。為了滿足商業(yè)化需求，有一種生產(chǎn)模型叫“流水線生產(chǎn)”，在這個模型中，待生產(chǎn)的產(chǎn)品從一個站點移動到另一個站點，即原材料在處理站中由訓(xùn)練有素的工作人員進行記錄、集中、激活，再移動到下一個站點進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，再轉(zhuǎn)移到相鄰的站點進行細(xì)胞增殖，最后在一個站點進行性能檢測后分裝凍存。已經(jīng)有公司建立了T細(xì)胞制造的模塊化平臺，其中由BioSpherix公司設(shè)計的Xvivo多功能細(xì)胞工作站是典型的例子。雖然模塊化生產(chǎn)流水線簡易了生產(chǎn)的過程，但仍然需要高技能操作員的操作處理。另一種模型是“單個設(shè)備生產(chǎn)模型”，它的特點是一個設(shè)備只用于生產(chǎn)一個患者產(chǎn)品，通過最小化用戶交互來解決上述問題。在這個模型中，每個設(shè)備獨立運行，一個人可同時監(jiān)督幾個單元。除了自動化程度的提高，該模型還可以防止由于每個工作單元的物理劃界造成的交叉污染，并提高設(shè)備的綜合利用。如該模型可實現(xiàn)在兩個運行程序間改變多個設(shè)備的設(shè)置而不改變細(xì)胞培養(yǎng)模式。這為該模型賦予了高度的靈活性和適應(yīng)性，因為一個生產(chǎn)單元的功能障礙不影響其他產(chǎn)品，并且可以被另一個生產(chǎn)單元快速替換。

4.2 來源材料

工程化T細(xì)胞的來源均是患者自身，收集患者體內(nèi)的T細(xì)胞并經(jīng)改造修飾后再重新注回患者體內(nèi)，這就決定了初始T細(xì)胞的狀態(tài)和性質(zhì)的不一致性。由于患者在接受化療或者放療過程中其自身T細(xì)胞含有各種水平的抑制因子掩蓋了T細(xì)胞的正常功能[60-62]，選擇合適的T細(xì)胞來源至關(guān)重要，目前有兩種策略來解決這個問題。

一是除去T細(xì)胞中的抑制因子。已經(jīng)有報道證明去除這些抑制因子后T細(xì)胞的治療效果明顯提高[63]。使用表面覆蓋有抗CD13和抗CD28的磁珠及其相應(yīng)裝置達(dá)到分離篩選和富集目的，也是一種有效的方法[64]。

二是使用特定的T細(xì)胞亞群。如記憶干細(xì)胞就是一種較好的原始材料。又如針對巨細(xì)胞病毒或EB病毒的內(nèi)源性抗原反應(yīng)性記憶T細(xì)胞，已被用于基因工程的源代T細(xì)胞[65]。

4.3 病毒載體

病毒載體被認(rèn)為是CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)過程的關(guān)鍵原料，因為正是它將CAR導(dǎo)入T細(xì)胞內(nèi)形成嵌合型抗體T細(xì)胞。且病毒載體可以大量生產(chǎn)并保存簡單，在--80℃下可穩(wěn)定保存4～9年[66-68]。

商業(yè)化CAR-T細(xì)胞的高效性和穩(wěn)定性與病毒載體的選擇以及載體優(yōu)化息息相關(guān)。常用的載體是基于γ病毒和慢病毒的復(fù)制缺陷型載體系統(tǒng)。慢病毒載體保留感染不分裂細(xì)胞的能力，因此具有很高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。第三代最小慢病毒載體在安全性能方面進一步提高[69-70]。

4.4 輔助材料

ACT產(chǎn)品的安全性、純度以及效率的高低不僅與自身質(zhì)量有關(guān)，與形成過程中的輔助材料也密不可分。這些輔助材料包括抗體、細(xì)胞因子、血清和病毒載體等。只有這些材料組分有效、穩(wěn)定地形成一個完整的體系，才能得到更好的產(chǎn)品。

同時，所有試劑必須遵循USP〈1043〉關(guān)于輔助材料的規(guī)定。需要注意的是由于其易變異的性質(zhì)限制了一些自然資源的使用[71]。如細(xì)胞培養(yǎng)基必須是無血清的以降低被瘋牛?。˙SE）病毒污染的風(fēng)險。

4.5 質(zhì)量控制

由于原材料的異質(zhì)性和生產(chǎn)過程的復(fù)雜性，需要仔細(xì)檢測產(chǎn)品的最終性能，如安全性、純度和效能，以符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[72]。與普通醫(yī)療產(chǎn)品相比，個性化治療產(chǎn)品需要對質(zhì)量進行更嚴(yán)格的把關(guān)，無論是材料的數(shù)量還是細(xì)胞產(chǎn)品的檢測時間都應(yīng)當(dāng)受到嚴(yán)格的控制，同時對凍存或者運輸過程的產(chǎn)品質(zhì)量也要時時檢測。這就要求，質(zhì)量控制步驟需要簡單化和標(biāo)準(zhǔn)化，以避免出錯，產(chǎn)生不可靠數(shù)據(jù)。

自動化有助于質(zhì)量控制流程的標(biāo)準(zhǔn)化。如流式細(xì)胞法分析培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)目，就受益于自動染色、獲取和分析過程；使用LIMS（實驗室信息和管理系統(tǒng)）自動采集和分析數(shù)據(jù)流可以快速生成標(biāo)準(zhǔn)化報告從而大大減少工作量。

利用自動跟蹤和批量記錄技術(shù)，從原材料采樣到患者回輸整個過程都進行跟蹤監(jiān)控以確保細(xì)胞的質(zhì)量[26]。也有報道稱，自動配料記錄系統(tǒng)與過程控制、質(zhì)量控制系統(tǒng)緊密聯(lián)系在一起，可以在生產(chǎn)結(jié)束后得到單個的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)記錄[41]，這樣可以比較不同制造場所和不同工藝下產(chǎn)品的質(zhì)量控制數(shù)據(jù)，有助于對產(chǎn)品進行改進。

4.6 管理條例的完善

臨床細(xì)胞產(chǎn)品的制造應(yīng)該得到社會各界的廣泛關(guān)注并且有詳細(xì)的法律法規(guī)來規(guī)范生產(chǎn)。所有的產(chǎn)品都應(yīng)該符合GMP規(guī)定。在歐美國家/地區(qū)都有明確的法律法規(guī)對生產(chǎn)商有詳細(xì)的規(guī)定，如第1394/2007號歐洲法規(guī)中的ATMP要求、美國衛(wèi)生與人類服務(wù)部文件中的“人體細(xì)胞治療和基因治療指南”等。而我國在此方面相對薄弱，因此需要相關(guān)部門行動起來，健全相關(guān)生產(chǎn)的法律法規(guī)。

5 展 望

ACT細(xì)胞療法具有巨大的發(fā)展前景，已成為全球治愈癌癥腫瘤的重要方法之一。在此背景下，其生產(chǎn)模式發(fā)展為學(xué)術(shù)和商業(yè)的合作伙伴關(guān)系，前者負(fù)責(zé)研發(fā)和測試新穎的想法，后者負(fù)責(zé)工業(yè)擴大使其成為醫(yī)療產(chǎn)品，如賓夕法尼亞大學(xué)與諾華公司的合作、中國人民解放軍總醫(yī)院與CBMG的合作等。這種模式對該領(lǐng)域的可持續(xù)發(fā)展有著重要的影響。

同時，ACT細(xì)胞療法也不可避免地面臨著一系列的挑戰(zhàn)。由于其本身的異質(zhì)性，人們始終質(zhì)疑其臨床的安全性、穩(wěn)定性以及實際效果[73]。雖然早在20世紀(jì)80年代末期就提出了CAR療法，但目前只在小型臨床試驗中取得成果[2]，因此想要擴大CAR的應(yīng)用范圍使其商業(yè)化和大眾化，還需要廉價、快速和自動化的生產(chǎn)制造。也有機構(gòu)一直在研究使用已有的第三方供體基因修飾的T細(xì)胞用于治療病毒感染的可能性[74]，希望能設(shè)計出特異性靶向不同患者癌細(xì)胞的獨特抗原的通用細(xì)胞療法。

相信，ACT細(xì)胞療法一旦成熟將會成為一項對抗癌癥和傳染病的強有力的工具，就像20年前的疫苗抗體一樣，為生物醫(yī)藥界帶來轉(zhuǎn)機。然而，考慮到目前面臨的種種挑戰(zhàn)，還需要學(xué)術(shù)界、產(chǎn)業(yè)界、監(jiān)管部門的共同努力。

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Commercial progress and prospect in adoptive T cell immunotherapy

MEI Yi1，2，YANG Siming1，2，BAI Zhonghu1，2，DAI Xiaofeng1，2
1. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China 2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

With the great success demonstrated by the clinical trials of several commercial products, adoptive T cell immunotherapy has become a novel class of therapeutics for complex disease treatment. However, some major challenges must be met to make engineered T cells a reliable, safe and effective remedy. This paper reviews the fundamental problems remain to be resolved and offers corresponding insights to make adoptive T cell therapy commercialisable.

adoptive T cell immunotherapy; clinical operation; manufacturing

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.05.009

梅義，江南大學(xué)生物工程學(xué)院、糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室碩士研究生。研究方向：腫瘤及生物信息學(xué)交叉研究

國家自然科學(xué)基金（31471251），江蘇省自然科學(xué)基金（BK20161130），江蘇省六項人才高峰計劃（SWYY-128），重點大學(xué)基礎(chǔ)研究計劃（JUSRP11507）