王 存，張 毅，孟 麗，趙 欣，王 躍

(重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心,重慶市功能性食品研發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室，重慶第二師范學(xué)院，重慶 400067)

聚(3-氨基-5-巰基-1,2,4-三唑)/多壁碳納米管修飾的玻碳電極同時(shí)檢測(cè)尿酸、黃嘌呤與次黃嘌呤

王 存，張 毅，孟 麗，趙 欣，王 躍*

(重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心,重慶市功能性食品研發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室，重慶第二師范學(xué)院，重慶 400067)

采用滴涂法得到多壁碳納米管(MWCNTs)修飾的玻碳電極(GCE)，通過(guò)電沉積方法將3-氨基-5-巰基-1,2,4-三唑(TA)沉積在MWCNTs/GCE表面，制備了聚(3-氨基-5-巰基-1,2,4-三唑)/多壁碳納米管修飾電極(pTA/MWCNTs/GCE)。采用循環(huán)伏安法(CV)和示差脈沖伏安法(DPV)，研究了尿酸(UA)、黃嘌呤(XA)和次黃嘌呤(HX)在該修飾電極上的電化學(xué)行為。結(jié)果表明，該修飾電極對(duì)UA、XA和HX均有較好的電催化活性作用，能實(shí)現(xiàn)對(duì)3種物質(zhì)的同時(shí)測(cè)定。UA、XA和HX在該修飾電極上的線性范圍分別為9.0～739.0、2.0～259.0、1.0～353.0 μmol/L; 檢出限分別為0.67、0.17、0.33 μmol/L。該修飾電極已成功用于尿液和血清實(shí)際樣品中UA、XA和HX的同時(shí)測(cè)定，回收率為98.8%～105.5%。

多壁碳納米管；3-氨基-5-巰基-1,2,4-三唑；尿酸；黃嘌呤；次黃嘌呤；電化學(xué)

尿酸(UA)、黃嘌呤(XA)和次黃嘌呤(HX)是人體中嘌呤降解代謝的主產(chǎn)物，主要存在于血液、肝臟和尿液中[1-2]。人體中UA、XA和HX的含量變化可以直接反映人體免疫和代謝等機(jī)能的狀況，同時(shí)也可檢測(cè)與嘌呤代謝有關(guān)的疾病。當(dāng)UA、XA和HX出現(xiàn)異常時(shí)，會(huì)出現(xiàn)如痛風(fēng)、高尿酸血癥、腎功能衰竭、白血病和肺炎等病癥[3-5]。因此，建立簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)分析UA、XA和HX的方法是十分必要的。當(dāng)前，UA、XA和HX的測(cè)定通常采用酶催化法[6]、高效液相色譜法(HPLC)[7]、毛細(xì)管電泳法[8]以及電化學(xué)方法[9]等。但酶催化法、HPLC法和毛細(xì)管電泳法普遍存在設(shè)備昂貴、耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、檢測(cè)組分單一且不能做活體實(shí)時(shí)分析等缺點(diǎn)，難以滿足日常檢測(cè)要求[10]。而電化學(xué)方法因具有選擇性與穩(wěn)定性好，靈敏性高，抗干擾能力強(qiáng)，能多組分同時(shí)檢測(cè)且可活體實(shí)時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn)成為研究的熱點(diǎn)[11-13]。但是由于UA、XA和HX在傳統(tǒng)的電極上具有很高的過(guò)電位，并且這3種物質(zhì)在傳統(tǒng)電極上的檢測(cè)電位非常接近，從而導(dǎo)致電極同時(shí)檢測(cè)三者比較困難，進(jìn)而導(dǎo)致傳感器的選擇性差[14-16]。鑒于此，本文采用聚(3-氨基-5-巰基-1,2,4-三唑)/多壁碳納米管修飾的玻碳電極對(duì) UA、XA和HX進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

3-氨基-5-巰基-1,2,4-三唑(TA)是一種低分子量的化學(xué)物質(zhì)，具有5個(gè)潛在的配位位點(diǎn)：3個(gè)N原子和2個(gè)C原子構(gòu)成骨架環(huán)，環(huán)外有1個(gè)NH2基團(tuán)和1個(gè)SH基團(tuán)[17]。采用電聚合的方法將TA修飾到電極表面，得到聚(3-氨基-5-巰基-1,2,4-三唑)薄膜(pTA)。研究表明，pTA不僅具有良好的導(dǎo)電性，好的化學(xué)穩(wěn)定性以及很強(qiáng)的電催化活性等優(yōu)點(diǎn)，而且該聚合膜具有好的滲透性，能促進(jìn)生物活性小分子的檢測(cè)[18-21]。多壁碳納米管(MWCNTs)因具有高的導(dǎo)電性，大的比表面積，好的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，引起了科學(xué)界的巨大興趣，成為材料科學(xué)研究熱點(diǎn)，此外，MWCNTs還具有良好的生物相容性。因此，MWCNTs的電催化性能及其在傳感器中的應(yīng)用受到了強(qiáng)烈的關(guān)注[19]。本文將pTA和MWCNTs共同修飾到玻碳電極表面，制成了一種新型的傳感器。該傳感器響應(yīng)快速、靈敏度高、選擇性好，對(duì)UA、XA和HX 有著良好的催化氧化性能，已成功用于實(shí)際樣品(尿液和血清)中UA、XA和HX 的同時(shí)測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

尿酸、黃嘌呤、次黃嘌呤和3-氨基-5-巰基-1,2,4-三唑(分析純，Aladdin試劑公司)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)由K2HPO4-KH2PO4配制，支持電解質(zhì)為0.1 mol/L KCl。其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

FA2004B電子天平(上海恒平科技有限公司)，KQ5200型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)，1000B掃描電子顯微鏡(美國(guó)Amray公司)。CHI-660E型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)，實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)的三電極系統(tǒng)：表面修飾的玻碳電極(直徑3 mm)為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極。以循環(huán)伏安法(CV)和示差脈沖伏安法(DPV)考察電極的電化學(xué)特性。

1.2 修飾電極的制備

將玻碳電極(GCE)在金相砂紙上依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化鋁粉拋光，然后分別在蒸餾水、乙醇、蒸餾水中超聲洗滌,清洗后的電極置于室溫下晾干。2 mg MWCNTs超聲分散于5 mL二次蒸餾水中，移取20 μL上述分散液滴涂于GCE表面，室溫下晾干，得到多壁碳納米管修飾電極(MWCNTs/GCE)。將MWCNTs/GCE放入聚合液中電沉積3-氨基-5-巰基-1,2,4-三唑(TA)，聚合液由1 mmol/L TA和0.1 mol/L H2SO4組成，采用循環(huán)伏安法(CV)，在-0.2～1.7 V之間以50 mV/s 循環(huán)掃描15圈，沉積結(jié)束后用蒸餾水沖洗電極，然后在0.1 mol/L PBS(pH 7.0) 緩沖溶液中掃至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定，室溫晾干，得到聚(3-氨基-5-巰基-1,2,4-三唑)/多壁碳納米管修飾的玻碳電極(pTA/MWCNTs/GCE)。

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾電極的SEM表征

采用掃描電子顯微鏡對(duì)MWCNTs/GCE和pTA/MWCNTs/GCE電極的表面形貌進(jìn)行表征(圖1)。由圖1A可見，許多單壁碳納米管纏繞，表明MWCNTs已均勻分散在玻碳電極表面。當(dāng)MWCNTs/GCE上進(jìn)一步修飾pTA后，在MWCNTs/GCE上可見一層均勻的聚合膜，且MWCNTs大部分包埋在pTA薄膜中(圖1B)，表明pTA/MWCNTs復(fù)合膜修飾電極制備成功。

圖1 MWCNTs/GCE(A)與pTA/MWCNTs/GCE(B)電極表面的掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron microscopy images of MWCNTs/GCE(A) and pTA/MWCNTs/GCE(B)

2.2 UA、XA及HX在不同修飾電極上的電化學(xué)響應(yīng)

圖2 GCE(a)、TA /GCE(b)、MWCNTs/GCE(c)與pTA/MWCNTs/GCE(d)的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms at GCE(a),TA /GCE(b),MWCNTs/GCE(c) and pTA/MWCNTs/GCE(d)

為研究pTA/MWCNTs/GCE的性能，實(shí)驗(yàn)比較了不同修飾電極在200 μmol/L UA、200 μmol/L XA和200 μmol/L HX混合溶液中的CV響應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，裸GCE(曲線 a)在檢測(cè)3種物質(zhì)時(shí)只有1個(gè)重疊的寬峰。TA/GCE(曲線 b)和MWCNTs/GCE(曲線 c)對(duì)XA和HX的響應(yīng)峰電流較小，對(duì)UA則幾乎沒有響應(yīng)。而目標(biāo)電極pTA/MWCNTs/GCE(曲線 d)上，UA、XA和HX的電信號(hào)明顯得到分離，其峰電位分別為0.34、0.73、1.06 V。UA、XA和HX之間的峰電位差分別為0.39、0.33 mV。結(jié)果表明，目標(biāo)電極對(duì)UA、XA和HX具有良好的催化活性，可望用于UA、XA和HX 混合物的同時(shí)檢測(cè)。

2.3緩沖液pH值對(duì)UA、XA與HX同時(shí)檢測(cè)的影響

本文采用CV研究了緩沖液pH值對(duì)pTA/MWCNTs/GCE同時(shí)檢測(cè) 50 μmol/L UA、50 μmol/L XA和50 μmol/L HX的影響。結(jié)果顯示，UA的峰電流隨pH值升高而降低。XA和HX的峰電流在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)先增加后減小，在pH 7.0時(shí)達(dá)到最大值。而隨著pH值的增大，UA、XA和HX的峰電位逐漸負(fù)移，表明這是質(zhì)子參與的電極反應(yīng)過(guò)程[22]。由于人體生理pH值約在7.0左右，為獲得高的靈敏度和選擇性，選擇pH 7.0的磷酸緩沖液作為測(cè)試底液。

圖3 傳感器對(duì)不同濃度UA的差分脈沖伏安圖Fig.3 Differential pulse voltammogram for different concentrations of UA at pTA/MWCNTs/GCE in 0.1 mol/L PBS(pH 7.0) HX:100 μmol/L,XA:70 μmol/L;concentrations of UA(from inner to outer):9，21，39，69，99，139，189，249，319，399，489，589，739，939，1 239 μmol/L;insert:plot of Ip vs.concentration for UA

2.4 示差脈沖伏安法同時(shí)測(cè)定UA、XA與HX

由于示差脈沖伏安法(DPV)比CV法具有更高的靈敏度和更好的檢測(cè)效果，因此本文選擇DPV同時(shí)檢測(cè)UA、XA和HX。將三者的混合溶液作為測(cè)試底液，改變其中1種物質(zhì)的濃度，保持其他2種物質(zhì)的濃度不變，然后分別檢測(cè)UA、HX和XA。結(jié)果表明，在最優(yōu)的條件下，UA、XA和HX的線性范圍分別為9.0～739.0、2.0～259.0、1.0～353.0 μmol/L，線性方程分別為：IUA(μA)=-6.618 18-0.098 27cUA(μmol/L)(r=0.987 0)；IXA(μA)=-7.217 07-0.148 22cXA(μmol/L)(r=0.980 1)和IHX(μA)=-13.367 5-0.091 53cHX(μmol/L)(r=0.981 2)。檢出限(3S/N)分別為0.67、0.17、0.33 μmol/L，圖3為100 μmol/L HX和70 μmol/L XA存在時(shí)不同濃度UA的差分脈沖伏安圖。

pTA/MWCNTs/GCE對(duì)UA、XA和HX選擇性響應(yīng)的機(jī)理推測(cè)如下：首先，在0.1 mol/L PBS(pH 7.0 ) 的緩沖溶液中，UA(pKa=5.75) 和 XA(pKa=7.70) 以陰離子的形式存在；HX(pKa=8.90)以陽(yáng)離子的形式存在[12,23]。陰離子形式存在的UA和XA通過(guò)靜電作用被pTA薄膜骨架環(huán)吸引，陽(yáng)離子形式存在的HX則通過(guò)氫鍵作用被pTA薄膜表面雜原子(N和S)吸引[12,24-25]。其次，pTA薄膜具有π-π共軛鍵，存在大量活性位點(diǎn)，這導(dǎo)致分析物與電極界面的不相似共軛效應(yīng)，有助于分析檢測(cè)電位相近的生物活性小分子[26-27]。此外，多壁碳納米管(MWCNTs)具有高的導(dǎo)電性，大的比表面積和良好的生物相容性等性質(zhì)，因此MWCNTs可以增強(qiáng)修飾電極檢測(cè)UA、XA和HX的電流響應(yīng)能力[28-29]。表1是本文與研究文獻(xiàn)的比較，相對(duì)文獻(xiàn)中碳納米管修飾電極或聚合物薄膜修飾電極，本文TA/MWCNTs修飾電極的檢出限較低，檢測(cè)范圍寬。

表1 不同研究電極之間的比較Table 1 Comparison of the response characteristics of different modified electrodes

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性與重現(xiàn)性

2.6 實(shí)際樣品分析

采用pTA/MWCNTs/GCE對(duì)人血清和尿液樣品中的UA、XA和HX進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。人血清和尿液未進(jìn)行任何處理，先分別用0.1 mol/L PBS(pH 7.0) 緩沖溶液稀釋100倍，檢測(cè)其中UA、XA和HX的含量，隨后加入一定量的UA、XA和HX標(biāo)準(zhǔn)溶液，最后檢測(cè)溶液中UA、XA和HX的總含量，測(cè)定結(jié)果見表 2。該方法對(duì)UA、XA和HX的測(cè)定回收率為98.8%～105.5%。

表2 實(shí)際樣品中UA、XA和HX的測(cè)定Table 2 Determination of UA，XA and HX in samples

3 結(jié) 論

本文成功制備了pTA/MWCNTs/納米復(fù)合材料，并將其用于修飾電極，構(gòu)建了一種新型的傳感器。該傳感器在同時(shí)檢測(cè)UA、XA和HX時(shí)表現(xiàn)出很高的電催化活性，解決了三者峰電位的重疊問(wèn)題，同時(shí)降低了過(guò)電位，且很大程度上提高了峰電流。研究表明，該方法簡(jiǎn)單快速，具有較寬的線性范圍、較高穩(wěn)定性、較強(qiáng)抗干擾能力，可用于人尿液和血清實(shí)際樣品中UA、XA和HX的同時(shí)測(cè)定。因此，該方法在實(shí)際樣品中同時(shí)檢測(cè)UA、XA和HX具有一定的研究意義和參考價(jià)值。

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Simultaneous Determination of Uric Acid,Xanthine and Hypoxanthine Based on poly(3-Amino-5-mercapto-1,2,4-triazole)/Multi-walled Carbon Nanotubes Modified Glassy Carbon Electrode

WANG Cun,ZHANG Yi,MENG Li,ZHAO Xin,WANG Yue*

(Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food,Chongqing Engineering Research Center of Functional Food,Chongqing Engineering Laboratory for Research and Development of Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China)

In this paper,the poly(3-amino-5-mercapto-1,2,4-triazole)/multi-walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode(pTA/MWCNTs/GCE) was successfully prepared by electrodepositing 3-amino-5-mercapto-1,2,4-triazole(TA) on the MWCNTs/GCE.The electrochemical behaviors of uric acid(UA),xanthine(XA) and hypoxanthine(HX) at the pTA/MWCNTs/GCE were investigated using cyclic voltammetry(CV) and differential pulse voltammetry(DPV).The results showed that the chemically modified electrode displayed excellent electrochemical catalytic activities towards UA,XA and HX.The calibration curves for UA,XA and HX were obtained over the ranges of 9.0-739.0，2.0-259.0,1.0-353.0 μmol/L with the detection limits of 0.67，0.17,0.33 μmol/L,respectively.In addition,the modified electrode was applied in the determination of UA,XA and HX in real samples(urine and serum),with the recoveries of the samples ranged between 98.8%-105.5%.

multi-walled carbon nanotubes; 3-amino-5-mercapto-1,2,4-triazole; uric acid; xanthine; hypoxanthine；electrochemistry

O657.1；O646

：A

：1004-4957(2017)09-1124-05

2017-04-27；

：2017-06-05

重慶市工程技術(shù)研究中心建設(shè)項(xiàng)目(cstc2015yfpt_gcjsyjzx0027)

*

：王 躍，博士，副教授，研究方向：材料化學(xué)，Tel：18716277698，E-mail:wangyue@cque.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.012