陳 鑫，周 真,2*，楊 旭，郭抗抗,2，李迪星

(1.哈爾濱理工大學(xué) 測(cè)控技術(shù)與通信工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；2.測(cè)控技術(shù)與儀器黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150080；3.哈爾濱電工儀表研究所，黑龍江 哈爾濱 150028)

紫外-可見光譜法定量檢測(cè)牛奶菌群總數(shù)的研究

陳 鑫1，周 真1,2*，楊 旭1，郭抗抗1,2，李迪星3

(1.哈爾濱理工大學(xué) 測(cè)控技術(shù)與通信工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；2.測(cè)控技術(shù)與儀器黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150080；3.哈爾濱電工儀表研究所，黑龍江 哈爾濱 150028)

針對(duì)平板計(jì)數(shù)、ATP生物發(fā)光等傳統(tǒng)牛奶菌群總數(shù)檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)，現(xiàn)有光譜技術(shù)操作復(fù)雜等問(wèn)題，將紫外-可見光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)應(yīng)用于牛奶中菌群總數(shù)的定量分析，并采用優(yōu)化的偏最小二乘法建立牛奶菌群總數(shù)的定量模型。以等時(shí)間段(0，2，4，…，20 h) 32 ℃恒溫下培養(yǎng)的牛奶為研究對(duì)象，探究光譜與牛奶菌群總數(shù)之間的定量關(guān)系。采用連續(xù)投影算法選出19個(gè)特征波數(shù)；再利用偏最小二乘模型建立基于特征波與菌群總數(shù)的模型關(guān)系；優(yōu)化后的模型具有更高的相關(guān)系數(shù)(Rp優(yōu)=0.978，Rp原=0.968)和更小的均方根誤差(RMSE優(yōu)=0.265，RMSE原=0.324)。該研究采用紫外-可見光譜檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)的方法為快速檢測(cè)牛奶菌群數(shù)量提供了新思路。

紫外-可見光譜；牛奶菌群；連續(xù)投影算法；偏最小二乘

乳及乳制品已成為人們?nèi)粘ｏ嬍持忻懿豢煞值囊徊糠郑c此同時(shí)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)心乳及乳制品的品質(zhì)。近期牛奶細(xì)菌含量超標(biāo)引發(fā)的安全事件頻發(fā)，檢測(cè)牛奶中細(xì)菌含量仍是重中之重。牛奶中菌群總數(shù)的檢測(cè)方法包括平板計(jì)數(shù)法、ATP生物發(fā)光、免疫測(cè)定、聚合酶鏈反應(yīng)和核酸探測(cè)等[1]，但這些方法大多存在用時(shí)較長(zhǎng)，操作復(fù)雜，不能進(jìn)行快速采集和檢測(cè)，所需的生物學(xué)試劑比較昂貴等缺點(diǎn)。因此需要一種快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法來(lái)確保牛奶的品質(zhì)。

近年來(lái)，光譜法因測(cè)量時(shí)間短等特點(diǎn)成為牛奶中細(xì)菌及營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)的熱點(diǎn)方法，常用的方法有生物熒光光譜法[2]、拉曼光譜法[3]、傅立葉變換紅外光譜法[4]等，上述方法均能快速檢出牛奶中菌群的總數(shù)，但生物熒光光譜和拉曼光譜在測(cè)量過(guò)程中需添加反應(yīng)試劑，而傅立葉變換紅外光譜操作復(fù)雜；同時(shí)上述方法檢測(cè)儀器較為昂貴。光與細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分等直接作用可產(chǎn)生紫外-可見透射光譜(200～400 nm)，通過(guò)光譜分析可以反演得到細(xì)胞形態(tài)和組成的相關(guān)信息，且該光譜測(cè)量技術(shù)具有無(wú)需反應(yīng)試劑、無(wú)損傷、測(cè)量過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。已有一些學(xué)者采用該技術(shù)在微生物領(lǐng)域開展了相關(guān)研究。Smith等[7]利用紫外-可見光譜對(duì)4種具有臨床意義的病原微生物進(jìn)行種類鑒別，方法具有較高的準(zhǔn)確度和精確度；Serebrennikova等[8]利用紫外-可見光譜對(duì)瘧原蟲的3個(gè)生長(zhǎng)階段加以研究，建立的模型可以準(zhǔn)確地體現(xiàn)瘧原蟲各階段的生長(zhǎng)性質(zhì)；王久悅等[9]利用紫外-可見光譜對(duì)水體中常見細(xì)菌微生物進(jìn)行了定性菌類鑒別，但紫外-可見光譜法應(yīng)用于牛奶細(xì)菌含量的定量分析鮮見報(bào)道。偏最小二乘(PLS)算法可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)回歸建模、數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化以及兩組變量間的相關(guān)分析，具有較高的預(yù)報(bào)穩(wěn)定性，所得到的模型參數(shù)與實(shí)際問(wèn)題的經(jīng)驗(yàn)規(guī)律較一致；能較高效地在多變量小樣本中最大限度地提取信息，廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)中多元數(shù)據(jù)回歸校正。但為得到預(yù)測(cè)能力較高的模型，在建模過(guò)程中需大量光譜數(shù)據(jù)，因而存在建模數(shù)據(jù)冗余的問(wèn)題。連續(xù)投影算法(Successive projections algorithm,SPA)在光譜多元定量和定性分析中應(yīng)用廣泛，能在嚴(yán)重重疊的光譜信息中剔除冗余復(fù)雜的光譜信息，進(jìn)而剔除各種非目標(biāo)因素對(duì)光譜的影響，減小建模變量，提高模型校正速度和建模效率。

本研究將紫外-可見光譜技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法結(jié)合應(yīng)用于牛奶中細(xì)菌含量的定量檢測(cè)。采用SPA優(yōu)選特征波數(shù)，再利用PLS模型建立基于特征波與細(xì)菌總數(shù)的模型關(guān)系，采用優(yōu)化的PLS建立牛奶細(xì)菌含量的定量模型，對(duì)紫外-光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)應(yīng)用于牛奶中細(xì)菌的檢測(cè)進(jìn)行了初步探究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品制備

隨機(jī)選取同批次的新鮮完達(dá)山袋裝牛奶，容量為250 mL/袋，消毒方式為巴氏消毒，貯存期限為4 ℃下7 d。將上述1 000 mL品牌牛奶放置于1 500 mL密閉、殺菌后的容器瓶中，在恒溫水浴箱中(32±1) ℃條件下恒溫培養(yǎng)；等時(shí)間間隔(0，2，4，…，20 h)采集樣品用于光譜檢測(cè)；重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程連續(xù)7 d。

1.2 儀器與試劑

TU-1900型紫外-可見分光光度計(jì)(波長(zhǎng)準(zhǔn)確度為±0.3 nm，安捷倫科技有限公司)；BS1200型電子天平(精度0.001 g，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；恒溫水浴培養(yǎng)箱(溫差為±1 ℃)；FINNPIPETTE F2型移液器(精度±0.1 mL，賽默飛世爾科技公司)。實(shí)驗(yàn)用水為無(wú)菌去離子水；無(wú)水乙醇(分析純)；生理鹽水：濃度為0.9%；平板計(jì)數(shù)瓊脂：參照GB/T 4789.2-2010[10]，SN/T 0168-2015標(biāo)準(zhǔn)方法[11]配制，主要成分為胰蛋白胨5 g/L，酵母浸粉2.5 g/L，葡萄糖1 g/L，瓊脂15 g/L，pH值7.0±0.2。

1.3 牛奶中菌落總數(shù)(Total viable counts，TVC)的計(jì)算

牛奶細(xì)菌含量參照GB/T4789.2-2010方法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟如下：

稱取平板計(jì)數(shù)瓊脂23.5 g，加入1 000 mL蒸餾水中，加熱煮沸溶解，121 ℃高溫滅菌15 min后備用。將文中“1.1”所述的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0，2，…，20 h)的牛奶樣品進(jìn)行稀釋，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，此品牌牛奶最佳稀釋度為104～107倍。使用移液器取1 mL各稀釋倍數(shù)的牛奶滴入一次性培養(yǎng)皿(直徑為90 mm)中，并與已滅菌的20 mL平板計(jì)數(shù)瓊脂混合均勻，靜置。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)放入恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)48 h，每個(gè)稀釋倍數(shù)制備3個(gè)培養(yǎng)皿。待菌群培養(yǎng)完成后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，該菌群數(shù)量為1 mL牛奶的菌群總數(shù)，且僅考慮菌落數(shù)目在30～300之間的培養(yǎng)皿。每毫升菌落數(shù)目的計(jì)算公式如下：

式中：∑c為所有適宜范圍內(nèi)的平板的菌落數(shù)之和(在30～300之間)。n1為第一稀釋度的菌落總數(shù)，n2為第二稀釋度的菌落總數(shù)，d為第一稀釋度的稀釋因子。

1.4 光譜數(shù)據(jù)采集

紫外-可見分光光度計(jì)開機(jī)預(yù)熱20 min后，運(yùn)行UVwin5光譜數(shù)據(jù)采集軟件，進(jìn)行儀器初始化。

樣品光譜掃描：利用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)牛奶樣品進(jìn)行透射光譜掃描，掃描范圍為200～400 nm，波長(zhǎng)準(zhǔn)確度為±0.3 nm，波長(zhǎng)重復(fù)性為0.1 nm，樣品池采用直徑為1 cm石英比色皿。每份樣品以等時(shí)間間隔從1 L牛奶樣品中取出5 mL滴入石英玻璃皿中，以0.9%生理鹽水作為參比，掃描次數(shù)50次，為減小光譜數(shù)據(jù)的測(cè)量誤差，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品測(cè)量5次，取平均值用于模型的建立。在測(cè)量下一時(shí)間點(diǎn)的樣品前，石英比色皿需用去離子水淋洗干凈，靜置5 min晾干后再滴入牛奶樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌落總數(shù)以及牛奶品質(zhì)變化趨勢(shì)

本實(shí)驗(yàn)考察了20 h內(nèi)的菌群總數(shù)對(duì)數(shù)(lgTVC)變化趨勢(shì)，結(jié)果顯示，新鮮完達(dá)山巴氏消毒牛奶的lgTVC值大多在3.02左右。在32 ℃恒溫培養(yǎng)20 h后，最終lgTVC值達(dá)到8.08。結(jié)果表明，牛奶中的菌群總量呈螺旋增長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后，菌群數(shù)量呈規(guī)律性增加。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，0 h新鮮牛奶顏色呈乳白色，色澤正常，無(wú)刺鼻異味，質(zhì)地均勻。隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，牛奶中菌群總數(shù)呈螺旋式上升，細(xì)菌的代謝會(huì)產(chǎn)生揮發(fā)性酯、酮、醛、脂肪酸、氨和胺的復(fù)雜混合物等，當(dāng)牛奶樣品中微生物數(shù)量達(dá)到108cfu/mL時(shí)，會(huì)顯現(xiàn)出氣味微苦、顏色微黃等特征；隨著細(xì)菌數(shù)目的增加，感官變化程度加深。

2.2 紫外-可見光譜

具有代表性的牛奶的紫外-可見光譜如圖1所示。從圖1中可以觀察到，0、4、8、20 h的牛奶在同一波長(zhǎng)下不同時(shí)刻的光譜數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)相同；由于細(xì)菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)核酸、吡啶二羧酸、色素在①部分(200～250 nm)較為敏感，在②部分(250～360 nm)吸收逐漸變?nèi)酰冖鄄糠?360～400 nm)細(xì)菌代謝產(chǎn)生的有機(jī)物的吸收優(yōu)勢(shì)逐漸明顯，因此①部分呈總體上升趨勢(shì)，②部分為波動(dòng)下降趨勢(shì)，③部分呈現(xiàn)緩慢波動(dòng)上升趨勢(shì)；但隨著時(shí)間的增加，牛奶中菌落數(shù)目的增加或者減少，映射為牛奶菌群紫外-可見光譜吸光度的增大或者減小。

圖1 未稀釋牛奶的原始光譜圖Fig.1 Raw spectrum of undiluted milk

2.3 SPA變量選取法提取特征波長(zhǎng)

貢獻(xiàn)點(diǎn)波長(zhǎng)的選擇是建立穩(wěn)定的數(shù)學(xué)模型的基礎(chǔ)，為了進(jìn)一步簡(jiǎn)化模型，本文采用SPA算法選取特征波長(zhǎng)。SPA算法是一種使矢量空間共線性最小化的前向變量選擇算法，其優(yōu)勢(shì)在于提取全波段的幾個(gè)特征波長(zhǎng)，能夠消除原始光譜矩陣中的冗余信息，可用于光譜特征波長(zhǎng)的篩選[12-14]。

連續(xù)投影算法SPA步驟如下：

步驟0：在第1次迭代前(n=1)，任選光譜矩陣Xcal的1列j，將建模集的第j列值賦給xj，j=1，…，J；

步驟1：將未選入的列向量位置的集合記為S。S={j，1≤j≤J，j{k(0),…,k(n-1)}}；

步驟2：分別計(jì)算xj對(duì)剩下列向量的投影Pxj=xj-(xjTxk(n-1))xk(n-1)(xk(n-1))Txk(n-1))-1，j∈S，P為投影算子；

步驟3：記k(n)=argmax(‖Pxj‖，j∈S)；

步驟4：記xj=Pxj，j∈S；

步驟5：令n=n+1，如果n

最后，得到的波長(zhǎng)是{k(n)；n=0,…,N-1}。

原始波長(zhǎng)數(shù)由401個(gè)經(jīng)過(guò)SPA算法變?yōu)?9個(gè)波長(zhǎng)，而且被選擇的這19個(gè)波長(zhǎng)按頻率由高到低順序排列(圖2)，標(biāo)記部分為篩選得到的19個(gè)特征波長(zhǎng)，分別為243.5、254.0、385.0、263.5、238.0、305.0、301.5、270.5、239.0、392.5、399.5、261.0、271.0、287.5、227.5、236.5、279.0、390.5、325.5 nm。采用連續(xù)投影算法后，建模變量數(shù)量大幅減少，極大地簡(jiǎn)化了模型的建立過(guò)程。圖3為連續(xù)投影算法結(jié)合多元線性回歸得到的結(jié)果，運(yùn)算過(guò)程中取得最小RMSE值的波長(zhǎng)數(shù)量為最優(yōu)特征波長(zhǎng)數(shù)。將選出的19個(gè)特征波長(zhǎng)繼續(xù)導(dǎo)入PLS模型建模，以便進(jìn)行下一步分析。

圖2 SPA算法優(yōu)選的特征波在光譜中位置Fig.2 Spectrum position of the characteristic wave optimized with SPA algorithm

圖3 SPA算法優(yōu)選的特征波數(shù)Fig.3 Characteristic wave number optimized with SPA algorithm

2.4牛奶菌群總數(shù)與光譜數(shù)據(jù)定量模型的建立

牛奶中微生物總量的定量模型的建立采用偏最小二乘(PLS)建模法[15-16]。采用偏最小二乘監(jiān)督學(xué)習(xí)算法的目的是構(gòu)建一個(gè)將輸入與目標(biāo)正確相關(guān)聯(lián)的模型，其中在校準(zhǔn)階段，輸入和輸出已知。PLS模型利用各個(gè)時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)的牛奶的紫外-可見光譜數(shù)據(jù)來(lái)預(yù)測(cè)lgTVC值。在校準(zhǔn)過(guò)程中，采用SPXY算法[17-18]將紫外-可見光譜數(shù)值和已知lgTVC值分為預(yù)測(cè)集和校正集。SPXY算法是在Kennard-Stone算法的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的常用的樣本劃分方法，是一種基于統(tǒng)計(jì)基礎(chǔ)的樣本集選擇方法，用光譜-理化值共生距離作為依據(jù)以保證最大程度表征樣本分布。該算法在樣本間距離的計(jì)算時(shí)，將光譜數(shù)據(jù)變量x和化學(xué)測(cè)量值變量y同時(shí)考慮在內(nèi)，p和q兩樣本間距離dxy(p，q)能有效地覆蓋光譜數(shù)據(jù)x的多維向量空間和化學(xué)測(cè)量值y空間，使所篩選出的變量對(duì)于某一種特定成分的校正集樣品更具有代表性和適用性，從而提高模型的預(yù)測(cè)能力和傳遞能力。然后采用SPA算法優(yōu)選特征波段，優(yōu)選過(guò)的光譜特征波段再次建立PLS模型。

分析牛奶的原始光譜的PLS模型表明，當(dāng)模型建立使用3個(gè)主成分因子時(shí)，模型具有較好的線性程度和預(yù)測(cè)能力(Rp原=0.968，RMSE原=0.324)，結(jié)果如圖4A所示。圖中表明估計(jì)的TVC值與已知的TVC值具有較高的相關(guān)性(即估計(jì)值和實(shí)際值接近此圖上的y=x直線)。

原始光譜全波段建立的PLS模型雖具有較好的預(yù)測(cè)能力和線性度，但在模型建立過(guò)程中，由于光譜數(shù)據(jù)較多，建模過(guò)程較為繁瑣；所以采用SPA算法優(yōu)選特征波段，該算法能夠以少量具有代表意義的數(shù)據(jù)建立更精準(zhǔn)的模型，優(yōu)選出的特征光譜波段和TVC值再次建立PLS模型，模型結(jié)果如圖4B所示。優(yōu)化后的模型具有更高的線性度(Rp優(yōu)=0.978)和更好的預(yù)測(cè)能力(RMSE優(yōu)=0.265)。總體來(lái)說(shuō)，PLS模型在菌數(shù)值高于1×106cfu/mL(圖1)時(shí)能得出較精確的預(yù)測(cè)結(jié)果。Nicolaou等[19]采用傅立葉紅外光譜檢測(cè)牛奶的腐敗程度，結(jié)果表明細(xì)菌含量在高于106cfu/mL時(shí)PLS模型具有較好的預(yù)測(cè)。本研究結(jié)論與此基本一致，驗(yàn)證了紫外-可見光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)于牛奶菌群含量測(cè)量的可行性。表1為原始光譜建模和特征波數(shù)建模參數(shù)的對(duì)比結(jié)果。

表1 原始光譜建模和特征波數(shù)建模參數(shù)對(duì)比Table 1 Comparison of original spectral modeling and characteristic wave number modeling parameters

3 結(jié) 論

本文將紫外-可見光譜分析技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)應(yīng)用于定量分析牛奶中細(xì)菌的含量，檢測(cè)時(shí)間僅30 s，且操作過(guò)程簡(jiǎn)單。利用優(yōu)化的PLS建立牛奶菌群含量的預(yù)測(cè)模型，優(yōu)化后的模型具有更好的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力(Rp優(yōu)=0.978，Rp原=0.968；RMSE優(yōu)=0.265，RMSE原=0.324)。研究結(jié)果表明，紫外-可見光譜技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的結(jié)合為檢測(cè)牛奶細(xì)菌含量提供了一種新的可能。

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Rapid Determination of Milk Bacteria by UV-Vis Spectroscopy

CHEN Xin1,ZHOU Zhen1,2*,YANG Xu1,GUO Kang-kang1,2,LI Di-xing3

(1.College of Measurement-Control Technology & Communications Engineering,Harbin University of Science & Technology,Harbin 150080,China; 2.The Higher Educational Key Laboratory for Measuring & Control Technology and Instrumentations of Heilongjiang Province,Harbin 150080,China；3.Harbin Research Institute of Electrical Instruments,Harbin 150028,China)

To solve the time-consuming problem of traditional detective methods,such as total viable counts and ATP bioluminescence technique,and the complicated operations of the existing spectrum techniques,a method for the quantitative analysis of the total number of bacteria in milk by UV-Vis spectroscopy combined with chemometrics,followed by application of the optimized partial least squares to set up the model of the total amount of milk bacteria.With the milk cultured in the same time period(0，2，4，…，20 h) as target,the quantitative relationship between the spectrum and the total number of milk bacteria was explored.The successive projections algorithm was applied to select 19 characteristic waves,and then the partial least squares model was used to establish the model relationship between the characteristic waves and the total number of milk flora.The correlation coefficientRof 0.978 in the optimized model was higher than that of 0.968 in primitive model,and the root mean square error(RMSE) of 0.265 in the optimized model was lower than that of 0.324 in the primitive model.The proposed method provided a new idea and direction for the rapid detection of the number of milk flora.

UV-Vis spectra；milk bacteria；successive projections algorithm；partial least squares

O433.1

：A

：1004-4957(2017)09-1109-05

2017-05-02；

：2017-06-21

黑龍江省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(11551315)

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：周 真,博士,教授,研究方向:生物信息檢測(cè)、可靠性技術(shù)研究，Tel:0451-86392318，E-mail:zhzh49@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.009