郝玉英，菅艷艷

1.包頭市中心醫(yī)院藥學(xué)處，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.包頭市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古包頭 014030

HPLC測(cè)定腦康沖劑中羥基紅花黃色素A的含量

郝玉英1，菅艷艷2

1.包頭市中心醫(yī)院藥學(xué)處，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.包頭市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古包頭 014030

目的 建立HPLC測(cè)定腦康沖劑中羥基紅花黃色素A含量的方法。 方法 選擇該院藥房2014年3月—2016年3月期間收集的腦康沖劑作為該次研究的調(diào)查對(duì)象，而后予以HPLC進(jìn)行測(cè)定，填充劑以及流動(dòng)相分別為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱和乙腈-0.7%磷酸溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為403.0 nm，最后對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行總結(jié)。 結(jié)果 羥基紅花黃色素A在0.075～1.869 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=7 110.467+3 689 880X r2=1。結(jié)論 該HPLC測(cè)定方法具有較強(qiáng)的專屬性和重現(xiàn)性，對(duì)羥基紅花黃色素A無(wú)任何影響，可用于腦康沖劑的質(zhì)量控制。

腦康沖劑；羥基紅花黃色素A；HPLC

腦康沖劑為該院在臨床使用五年以上的經(jīng)驗(yàn)方，具有悠久的歷史與可靠的療效，處方由黃芪、當(dāng)歸、川芎、紅花等12味中藥組成，它的功效是活血化瘀、散瘀通經(jīng)絡(luò)，用于腦出血、腦外傷、腦梗死患者恢復(fù)期使用[1-3]。據(jù)相關(guān)資料顯示，紅花的主要構(gòu)成為：黃酮類化合物、色素以及脂肪酸，同時(shí)還包括揮發(fā)油和多炔等。近年來(lái)，醫(yī)療技術(shù)日新月異的發(fā)展，HPLC測(cè)定法應(yīng)運(yùn)而生，并取得了臨床的高度認(rèn)可廣泛應(yīng)用[4]。與此同時(shí)，該檢測(cè)方測(cè)定羥基紅花黃色素A具有多種優(yōu)勢(shì)，如具有較高的專屬性和重現(xiàn)性。鑒于此，該次實(shí)驗(yàn)為探究該檢測(cè)方法的臨床價(jià)值，選擇該院藥房2014年3月—2016年3月期間收集的腦康沖劑進(jìn)行分析，現(xiàn)將研究過(guò)程和結(jié)果進(jìn)行如下匯報(bào)。

1 使用儀器和試劑

使用儀器：該次研究中的檢測(cè)器型號(hào)為SPD-10Avp型，泵型號(hào)為C—10ATvp。同時(shí)配合電子天平和紫外分光光度儀。使用試劑：該次研究中的使用試劑為羥基紅花黃色素 A，包頭市中心醫(yī)院提供腦康沖劑膠囊 （批號(hào)：20120605、20130910、20140102）；準(zhǔn)備自制的模擬樣品、高純度的水、色譜純以及分析純[5]。

2 研究方法

2.1 色譜參數(shù)

該次研究中將十八烷基硅烷鍵合硅膠作為色譜柱填充劑，phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為該儀器的型號(hào)。

2.2 流動(dòng)相

依據(jù)《中國(guó)藥典》選擇適宜的流動(dòng)相，即：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液，同時(shí)選擇適宜的測(cè)定方法。值得注意的是，該次研究所提供的基紅花黃色素A分具有較高的理論板數(shù)和分離度，保留時(shí)間良好，因此符合檢測(cè)流動(dòng)相的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 柱溫：室溫

選擇適宜的檢測(cè)波長(zhǎng)：檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：選取羥基紅花黃色素A，而后對(duì)其精密稱取，而后選擇甲醇，濃度為25%，將其制成溶液，確保1 mL含40 μg，波長(zhǎng)掃描范圍需合理選擇，正常參數(shù)為300～500 nm之間。最后依據(jù)《中國(guó)藥典》對(duì)羥基紅花黃色素A的測(cè)定方法進(jìn)行規(guī)范，檢測(cè)波長(zhǎng)參數(shù)為404 nm，結(jié)果表明，檢測(cè)波長(zhǎng)參數(shù)404 nm時(shí)，羥基紅花黃色素A吸收顯著[6-8]。明確理論板數(shù)：據(jù)大量研究表明，理論板數(shù)超過(guò)3 500，羥基紅花黃色素A具有較高的分離度，但是，由于理論版數(shù)的不同，使用的色譜柱也存在差異性，因此，在明確理論板數(shù)時(shí)，羥基紅花黃色素A峰不得在2 500以下。

2.4 溶劑的提取以及結(jié)果分析

選擇適宜的溶液：通過(guò)查閱《中國(guó)藥典》可知，溶劑的提取選擇甲醇，且濃度為25%。考察提取效率：提取液選擇濃度為25%的甲醇，使用劑量為50 mL，在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行提取，功率參數(shù)和頻率參數(shù)分別為300 W、50 kHz。要想被測(cè)成分完全提出得以保證，需選擇合理的考察時(shí)間，超聲提取時(shí)間為30、40 min以及50 min時(shí)，最后分析提取效率對(duì)羥基紅花黃色素A含量的影響。結(jié)果顯示：羥基紅花黃色素A的含量在超聲提取30、40 min以及50 min時(shí)，含量未發(fā)生任何變化，因此臨床選擇40 min作為提取時(shí)間。提取溶劑加入量結(jié)果分析：提取溶劑為25 mL時(shí)，會(huì)降低樣品羥基紅花黃色素A的含量，而提取溶劑為50、75 mL時(shí)，樣品羥基紅花黃色素A含量雷同，未發(fā)生變化，且提取效果顯著，因此，50 mL作為提取溶劑的加入量。

2.5 專屬性

選擇適量羥基紅花黃色素A作為對(duì)照品溶液，稱定時(shí)需確保精密，而后加入濃度為25%的甲醇，最后制成的樣品確保每1 mL含30 ug溶液。選取2 g該品的粉末制備稱供試品，待精密稱量后在塞錐形瓶中放置，與此同時(shí)，將50 mL甲醇加入其中，濃度為25%，對(duì)其整體重量進(jìn)行稱定。待上述操作完成后進(jìn)行超聲處理，功率參數(shù)和頻率參數(shù)分別為300 W、50 kHz，時(shí)間為40 min，在低溫度下保存，而后再次對(duì)重量進(jìn)行稱定，減失的重量會(huì)用甲醇進(jìn)行補(bǔ)足，最后進(jìn)行搖勻和過(guò)濾[9-11]。陰性對(duì)照供試品選擇雷同制備工藝進(jìn)行，陰性對(duì)照溶液方法以供試品的方法為主，在以上敘述的色譜條件下，對(duì)對(duì)照品溶液、供試品溶液以及陰性對(duì)照溶液進(jìn)行選取，劑量均為20 uL，在液相色譜儀中將上述3種溶液分別注入，檢測(cè)結(jié)果顯示：陰性對(duì)照組色譜圖結(jié)果同對(duì)照品和供試品進(jìn)行比對(duì)，在相應(yīng)的保留時(shí)間處色譜峰均未出現(xiàn)，由上述結(jié)果可知，陰性對(duì)照組溶液不會(huì)影響羥基紅花黃色素A。

2.6 線性關(guān)系分析

選擇適宜的羥基紅花黃色素A對(duì)照品，待完成精密稱量后，將25%甲醇加入其中，確保制成的樣品每1 mL含0.3 mg的溶液，將其充當(dāng)對(duì)照品溶液；而后對(duì)上述制成的溶液進(jìn)行精密量取，劑量分別為0.6 mg、1.2、2.4、3、6 mL以及15mL，待量取完成后在25mL的量瓶中分別置入，隨后將甲醇加入其中，直至達(dá)到刻度線為止，充分搖勻。在色譜儀中加入精密吸取10 μL溶液，而后對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，回歸分析峰面積和濃度的相關(guān)性，檢測(cè)結(jié)果表明：在0.075～1.869 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y= 7 110.467+3 689 880X r2=1。除此之外，另選同一份供試品溶液，測(cè)定時(shí)間分別為0、2、6、10 h以及12 h。結(jié)果表明：12 h內(nèi)，羥基紅花黃色素A的峰面積積分值穩(wěn)定性較好。

2.7 精密度及準(zhǔn)確度

選取批號(hào)相同的樣品進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，研細(xì)，取6份，供試品的選取劑量為10 μL，而后在液相色譜儀中注入，對(duì)每份樣品的含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算方法依據(jù)外標(biāo)法。精密稱量供試品9份，劑量均為1 g，在9個(gè)具塞錐形瓶中分別置入，隨后均分3組，每組樣品各3份，在此期間，將羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液加入其中，濃度需確保0.311 5 mg/mL，使用劑量分別為2、3 mL以及4 mL，與此同，將48、47、46 mL的甲醇溶液也加入其中，測(cè)定每份含量，計(jì)算回收率。

3 測(cè)定樣品

對(duì)3批樣品的含量進(jìn)行測(cè)量，與此同時(shí)，對(duì)同批的模擬樣品進(jìn)行測(cè)量。前者的批號(hào)分別為 20120605、20130 910、20140102，后者的批號(hào)為20150301。

4 結(jié)果

羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液利用流動(dòng)相進(jìn)行配置，而后使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度掃描，波長(zhǎng)參數(shù)在200～50 nm之間，結(jié)果顯示：在226 nm處和402 cm處可見(jiàn)兩個(gè)吸收峰，如圖1、圖2。由此可見(jiàn)，檢測(cè)波長(zhǎng)參數(shù)為226 nm時(shí)，雜質(zhì)干擾相對(duì)嚴(yán)重，檢測(cè)波長(zhǎng)參數(shù)為402 nm時(shí)，雜質(zhì)峰相對(duì)較少，無(wú)任何干擾，具有較高的靈敏度，因此檢測(cè)波長(zhǎng)選擇402 nm。

選取羥基紅花黃色素A，而后對(duì)上述制成的溶液進(jìn)行精密量取，劑量分別為 0.10、0.25、0.50、1.00 mL以及2.00 mL，待量取完成后在5 mL的量瓶中分別置入，對(duì)其進(jìn)行分離和檢測(cè)。結(jié)果顯示：羥基紅花黃色素A在0.075～1.869 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=7 110.467+ 3 689 880X r2=1。

圖1 可見(jiàn)吸收廣譜

圖2 對(duì)照品與樣品的色譜圖

5 結(jié)論

腦康沖劑的主要成分為紅花、枸杞、枳實(shí)，還包括當(dāng)歸以及川芎等，該藥物可以起到填精益髓和補(bǔ)腎養(yǎng)血的作用，在老年癡呆、血管癡呆、小兒腦癱以及腦血管病中較為適用。紅花為菊科紅花屬植物紅花的干燥花，屬于新興的油料作物，不僅可以活血痛經(jīng)，同時(shí)可以祛瘀止痛。與此用時(shí)紅花可以將心腦血管病的血液流變參數(shù)予以改善，心肌可以得到保護(hù)，同時(shí)將患者的心功能有效改善。除此之外，紅花可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外鈣離子，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和壞死進(jìn)行預(yù)防。近年來(lái)，種植面積的不斷增加，產(chǎn)量也逐年提升，在天然食用色素和保健食品中大量紅花被應(yīng)用，據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)結(jié)果顯示，紅花可以通過(guò)清除氧自由基而減輕實(shí)驗(yàn)性腦缺血再灌注損傷，且其具有抗凝血、血栓形成的作用，與此同時(shí)，紅花具有降血壓和降血脂的作用。尤其在腦血管疾病方面具有顯著的效果。近期研究表明[11]，紅花的主要成分為羥基紅花黃色素A，且測(cè)定方法主要為兩種，一種為分光光度法，另一種為感官評(píng)定法，但是對(duì)其功效成分含量的測(cè)定研究少之又少。有學(xué)者利用高效液相色譜法對(duì)紅花中黃色素的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，3個(gè)產(chǎn)地紅花中的羥基紅花黃色素A和紅花黃色素A占黃色素總量的88%。從該次研究結(jié)果結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，羥基紅花黃色素A在0.075～1.869 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=7 110.467+3 689 880X r2=1，而在Tian-xue等專家[12]的研究中，羥基紅花黃色素A在0.278～1.528 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，對(duì)應(yīng)回歸方程為：Y=4 220 000X-52 200，r=0.999 6，這一研究結(jié)果與該次研究結(jié)果基本一致。與此同時(shí)，紅花黃色素A藥理活性較強(qiáng)，其中含量最高的為羥基紅花黃色素。

通過(guò)HPLC測(cè)定可知，該方法具有較強(qiáng)的專屬性和重現(xiàn)性，對(duì)羥基紅花黃色素A無(wú)任何影響，可用于腦康沖劑的質(zhì)量控制。

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HPLC in Measuring the Content of Hydroxysafflor Yellow A in the Naokang Instant Granules

HAO Yu-ying1,JIAN Yan-yan2
1.Department of Pharmacy,Baotou Central Hospital,Baotou,Inner Mongolia,014040 China；2.Baotou Food and Drug Inspection and Testing Center,Baotou,Inner Mongolia,014030 China

Objective To establish a method of HPLC in measuring the content of hydroxysafflor yellow A in the naokang instant granules.Methods The naokang instant granules collected in our hospital from March 2014 to March 2016 were selected and measured by the HPLC,and the filler and mobile phase were respectively octadecylsilane chemically bonded silica and acetonitrile-0.7%phosphoric acid solution and the detection wavelength was 403.0 nm,and finally the test results were summarized.Results The liner relationship of hydroxysafflor yellow A in the 0.075～1.869 μg was good,and the regression equation was Y=7 110.467+3 689 880X r2=1. Conclusion The specificity and reproducibility of the HPLC measurement method are strong,which has no effect on the hydroxysafflor yellow A and it can be used as the quality control of naokang instant granules.

Naokang instant granules;Hydroxysafflor yellow A;HPLC

R927

A doi10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.02.13

2017-03-10；

2017-03-25

郝玉英（1971-），女，內(nèi)蒙古包頭人，本科，副主任藥師，研究方向：醫(yī)院制劑的研發(fā)。