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(天津天獅學(xué)院,天津 301700)

響應(yīng)面法分析多酚物質(zhì)間的協(xié)同抗氧化作用

石艷賓,李景,劉浩

(天津天獅學(xué)院,天津 301700)

以DPPH自由基清除率為抗氧化活性評價(jià)指標(biāo),選擇抗氧化較強(qiáng)的茶多酚、兒茶素、綠原酸、沒食子酸為影響因素,運(yùn)用響應(yīng)面法分析多酚物質(zhì)間的抗氧化協(xié)同作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,茶多酚、兒茶素、綠原酸、沒食子酸對DPPH自由基清除率的影響非常顯著,影響順序依次為沒食子酸、兒茶素、茶多酚、綠原酸。多酚物質(zhì)間存在一定的交互作用,但交互作用不顯著(除茶多酚與沒食子酸)。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中除了1、13組外,其他復(fù)配組合的協(xié)同系數(shù)SE均小于1,表明多酚物質(zhì)間的協(xié)同抗氧化作用不明顯。

多酚物質(zhì),抗氧化,DPPH,響應(yīng)面

隨著我國食品行業(yè)的快速發(fā)展,單一抗氧化劑的效果已經(jīng)不能滿足人們的需求,復(fù)配抗氧化劑已成為食品抗氧化劑發(fā)展趨勢,協(xié)同抗氧化已引起國內(nèi)外研究的高度關(guān)注[1-4]。多酚類物質(zhì)是一類存在于植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)的混合物,包括黃酮類、單寧類、酚酸類以及花色苷類等物質(zhì)。多酚物質(zhì)在清除自由基能力方面表現(xiàn)了較好的抗氧化性[5-7],能與維生素C(Vitamin C,VC)、維生素E、胡蘿卜素等其他抗氧化物在體內(nèi)一起發(fā)揮抗氧化功效[1],已成為具有廣泛開發(fā)前景的天然抗氧化劑。茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱,包括兒茶素類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等,主要功效成分為兒茶素類(主要包括表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素沒食子酸酯)。茶多酚及其衍生物具有解毒、抗輻射、抗氧化、抑菌等作用,在《GB 2760-2014食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中已作為典型的抗氧化劑,應(yīng)用于肉類、油炸、焙烤、飲料、膨化、果醬等多種食品[7-9]。綠原酸是一種生物活性較強(qiáng)的酚型抗氧化劑,被廣泛用于醫(yī)藥保健行業(yè),具有抗菌消炎、保肝利膽、清熱解毒、清除自由基及抗脂質(zhì)過氧化等作用[10-11]。沈維治等[12]在分析桑葉多酚單體的協(xié)同抗氧化作用中指出,含有綠原酸的多酚單體組合具有協(xié)同抗氧化作用,而不含綠原酸的多酚單體組合則全部表現(xiàn)出拮抗作用。本文選擇茶多酚、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、沒食子酸等具有代表性的酚型抗氧化劑,并以VC為對照,以DPPH自由基的清除率為抗氧化活性評價(jià)指標(biāo),比較這幾種多酚物質(zhì)的抗氧化能力的大小。運(yùn)用響應(yīng)面法[13]及復(fù)配溶液協(xié)同系數(shù)分析多酚物質(zhì)間的抗氧化協(xié)同與拮抗作用,為天然酚型抗氧化劑的深度開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) sigma公司;茶多酚、兒茶素、沒食子酸、綠原酸(純度≥98%) 上海源葉生物科技有限公司;表兒茶素(純度≥98%) 華中海威(北京)基因科技有限公司;維生素C、甲醇為分析純 天津江天化工技術(shù)有限公司。

UV1000紫外可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;AL204分析天平 梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2 響應(yīng)面法分析多酚類物質(zhì)間的抗氧化作用 在分析比較茶多酚、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、沒食子酸清除DPPH自由基能力的基礎(chǔ)上,選擇抗氧化能力較強(qiáng)的茶多酚、兒茶素、綠原酸、沒食子酸為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的影響因素,應(yīng)用響應(yīng)面法分析多酚物質(zhì)間的相互作用。由于實(shí)驗(yàn)中考察四種物質(zhì)的協(xié)同抗氧化作用,設(shè)置樣品的最大濃度為15 μg/mL,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼見表1。將四種抗氧化物質(zhì)配制成樣品溶液濃度為5、10、15 μg/mL,分別取10 mL混合均勻后,依據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.2.1測定復(fù)配混合液的DPPH自由基清除能力。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,應(yīng)用SAS9.3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,建立多元二次回歸模型,分析多酚物質(zhì)間的協(xié)同抗氧化作用。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table 1 Experimental variables and levels for Box-Behnken design

1.2.3 復(fù)配溶液抗氧化協(xié)同系數(shù)(SE)計(jì)算 抗氧化協(xié)同系數(shù)SE取決于實(shí)驗(yàn)得到的清除率(ESC)和理論計(jì)算的清除率(TSC)之間的比率。當(dāng)SE>1,表示有協(xié)同作用;SE<1,沒有明顯的協(xié)同作用;實(shí)驗(yàn)清除能力(ESC)的計(jì)算如1.2.1所述。協(xié)同系數(shù)可由如下公式計(jì)算[15]:

理論清除能力(TSC)的計(jì)算如下:

TSC(%)=(ESC1+ESC2+…+ESCn)-(ESC1×ESC2×…ESCn)/102(n-1)

其中,ESC1,…,ESCn表示單一抗氧化劑的實(shí)驗(yàn)清除率;n代表DPPH自由基評價(jià)體系中抗氧化劑的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1多酚物質(zhì)抗氧化能力比較

將茶多酚、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、沒食子酸、VC配制成系列濃度梯度樣品溶液,依據(jù)1.2.1實(shí)驗(yàn)方法,測定各個(gè)樣品溶液反應(yīng)后的吸光度值,計(jì)算半數(shù)清除率IC50,比較多酚物質(zhì)清除DPPH自由基能力的大小,結(jié)果見圖1和表2。

圖1 不同多酚物質(zhì)對DPPH自由基的清除率Fig.1 DPPH· scavenging capacity of different polyphenols

樣品茶多酚兒茶素表兒茶素綠原酸沒食子酸VCIC5014.3112.5822.0316.7911.7120.15

由圖1可知,DPPH自由基清除率隨著有效質(zhì)量濃度的增大而呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。但當(dāng)樣液濃度達(dá)到40 μg/mL后,這種現(xiàn)象不明顯且逐漸趨于平緩。以半數(shù)清除率IC50為多酚物質(zhì)抗氧化性能的評價(jià)指標(biāo),比較茶多酚、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、沒食子酸對DPPH自由基清除能力。IC50值越低,表明該多酚物質(zhì)抗氧化能力越強(qiáng),反之越弱。由表2可知,茶多酚、兒茶素、綠原酸、沒食子酸的半數(shù)清除率IC50值小于對照品VC的IC50值,均具有較強(qiáng)的抗氧化性。

2.2多酚物質(zhì)間抗氧化作用分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,依據(jù)表1進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),考察茶多酚、兒茶素、綠原酸、沒食子酸對DPPH自由基清除率的影響,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及復(fù)配溶液協(xié)同系數(shù)SE值的計(jì)算結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果及SE值Table 3 Experimental results and SE of Box-Behnken design

2.2.2 方差分析 利用軟件SAS9.3對表3中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,分析結(jié)果見表4。茶多酚(A)、兒茶素(B)、綠原酸(C)、沒食子酸(D)的p值均小于0.0001,表明這四個(gè)因素對DPPH自由基清除率的影響非常顯著。各影響因子間存在一定的交互作用,交互作用AD對DPPH自由基清除率的影響顯著,其他各影響因子間的交互作用較小。多酚物質(zhì)間交互作用由大到小依次為:A與D、B與D、C與D、B與C、A與C、A與B。

2.2.3 回歸模型的建立及抗氧化性分析 對響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析,建立全變量二次回歸模型為:DPPH自由基清除率(%)=19.883+1.432A+1.810B+0.573C+1.832D-0.016A2+0.004AB+0.007AC-0.045AD-0.039B2-0.009BC-0.020BD-0.014C2+0.010CD+0.013D2

由表4可知,模型p<0.0001,表明回歸模型非常顯著;失擬項(xiàng)p=0.1055>0.05,即失擬項(xiàng)不顯著,表明該模型是茶多酚、兒茶素、綠原酸和沒食子酸協(xié)同抗氧化分析的適合數(shù)學(xué)模型。本實(shí)驗(yàn)的校正R2值為0.9771,表明回歸方程的擬合度較好。回歸方程系數(shù)的顯著性結(jié)果表明:A、B、C、D對DPPH自由基清除率的影響非常顯著,影響順序依次為D、B、A、C;AD、B2對DPPH自由基清除率的影響顯著。所有一次項(xiàng)系數(shù)均為正值,表明A、B、C、D對DPPH自由基清除率有正相關(guān)性;A與B、A與C、C與D的交互項(xiàng)系數(shù)為正值,表明兩因素間對DPPH自由基清除率存在正相關(guān)性;A與D、B與C、B與D的交互作用系數(shù)為負(fù)值,表明其對DPPH自由基清除率存在負(fù)相關(guān)性。

2.2.4 響應(yīng)面交互作用分析 應(yīng)用SAS9.3對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,并繪制出響應(yīng)曲面圖2～圖7。隨著多酚物質(zhì)含量的增加,DPPH清除率也隨著增大。同時(shí),響應(yīng)曲面的坡度比較陡峭,說明四種多酚物質(zhì)對DPPH自由基清除率的影響顯著,沒食子酸的清除效果明顯強(qiáng)于茶多酚、兒茶素、綠原酸。整體上，四種酚型抗氧化物質(zhì)間存在一定的交互作用,但不顯著。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)配組合中除了1、13組,其他復(fù)配組合SE均小于1,可能是由于在質(zhì)量濃度5～15 μg/mL范圍內(nèi),沒食子酸與茶多酚、沒食子酸與兒茶素、兒茶素與綠原酸間存在負(fù)相關(guān)性。

圖2 A和B對DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Influence of A and B on DPPH· scavenging capacity

圖3 A和C對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Influence of A and C on DPPH· scavenging capacity

圖4 A和D對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Influence of A and D on DPPH· scavenging capacity

表4 回歸模型方差與分析Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model

圖5 B和C對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Influence of B and C on DPPH· scavenging capacity

圖6 B和D對DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Influence of B and D on DPPH· scavenging capacity

圖7 C和D對DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Influence of C and D on DPPH· scavenging capacity

注:*表示差異顯著,p<0.05;**表示差異非常顯著,p<0.01。

3 結(jié)論

茶多酚、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、沒食子酸為典型的酚型抗氧化劑,經(jīng)比較茶多酚、兒茶素、綠原酸、沒食子酸清除DPPH自由基能力高于對照品VC。利用響應(yīng)面法及復(fù)配溶液協(xié)同系數(shù)分析四種物質(zhì)間的協(xié)同抗氧化作用。茶多酚與兒茶素、茶多酚與綠原酸、綠原酸與沒食子酸對DPPH自由基清除率存在正相關(guān)性,沒食子酸與茶多酚、沒食子酸與兒茶素、兒茶素與綠原酸對DPPH自由基清除率存在負(fù)相關(guān)性。鑒于茶多酚與沒食子酸、沒食子酸與兒茶素、兒茶素與綠原酸在濃度為5～15 μg/mL間存在負(fù)相關(guān)性,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中除了1、13組,其他響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)復(fù)配協(xié)同系數(shù)SE均小于1。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中有效質(zhì)量濃度較低,且涉及四種物質(zhì)間DPPH清除效果的相互作用,研究結(jié)果還不能完全揭示出茶多酚與多個(gè)單體酚間抗氧化的相互作用關(guān)系。因此,在以后的研究中將進(jìn)一步研發(fā)酚型抗氧化劑兩者之間、三者之間復(fù)配的相互作用關(guān)系,為復(fù)合型天然酚型抗氧化劑深度開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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Synergisticantioxidantactivityamongpolyphenolsbyresponsesurfacemethodology

SHIYan-bin,LIJing,LIUHao

(Tianshi College,Tianjin 301700,China)

DPPH free radical clearance was used as the evaluation index of antioxidant activity. Because tea polyphenols,catechins,chlorogenic acid and gallic acid had stronger antioxidant,they were selected as influencing factors. The synergistic antioxidant activity of the mixture of polyphenols was analyzed by the response surface methodology. Tea polyphenols,catechins,chlorogenic acid,gallic acid had significant effect on the capacity of scavenging DPPH free radicals. The capacity of scavenging DPPH free radicals was as follows:gallic acid,catechin,tea polyphenols,chlorogenic acid. There were interactions between polyphenols,but the interaction was not significant for the capacity of scavenging DPPH free radicals(except gallic acid and tea polyphenols). Except the first experiment and the thirteen experiment,the collaborative SE of other response surface experiments were less than 1,and the synergy of polyphenols was not obvious.

polyphenols;antioxidant activity;DPPH;response surface methodology

2017-02-21

石艷賓(1977-)，女，碩士，高級工程師，研究方向：天然產(chǎn)物開發(fā)與應(yīng)用，E-mail:sybst2003@126.com。

TS201.1

:A

:1002-0306(2017)17-0061-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.012