周佳，齊紅藝

(1.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 611731；2.西南大學(xué)，重慶 400715)

·基礎(chǔ)研究·

HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定玄參中8個(gè)成分的含量△

周佳1*，齊紅藝2

(1.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 611731；2.西南大學(xué)，重慶 400715)

目的：建立HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定玄參中梓醇、哈巴苷、梔子苷、類葉升麻苷、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、5-羥甲基糠醛8個(gè)成分的含量。方法：采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃，以甲醇-0.05%甲酸水為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為0.6 mL·min-1，進(jìn)樣量2 μL，ESI源，正離子-MRM模式下檢測(cè)；結(jié)果：梓醇、哈巴苷、梔子苷、類葉升麻苷、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、5-羥甲基糠醛質(zhì)量濃度分別在0.194 0～7.76(r=0.999 0)、0.173 8～32.85(r=0.999 8)、0.394～23.64(r=0.996 4)、0.279 5～16.77(r=0.997 4)、0.3095～12.38(r=0.999 4)、0.087～5.220(r=0.999 1)、0.264 5～31.74(r=0.999 8)、0.034 3～1.370 0 μg·mL-1(r=0.999 2)線性關(guān)系良好，檢出限(LOD)為5～50 ng·mL-1，平均回收率為91.33%～99.78%。樣品測(cè)定結(jié)果顯示，玄參中哈巴俄苷、哈巴苷及安格洛苷C含量較高，分別為1.517～9.735、0.289～5.997、0.898～3.568 mg·g-1。不同來(lái)源的樣品中，8個(gè)成分的含量及各個(gè)成分之間比例存在較大差異。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立了在22 min內(nèi)同時(shí)測(cè)定玄參中8個(gè)成分含量的方法，靈敏度高，準(zhǔn)確度好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為玄參質(zhì)量提供參考。

玄參；梓醇；哈巴苷；梔子苷；類葉升麻苷；安格洛苷C；肉桂酸；哈巴俄苷；5-羥甲基糠醛；HPLC-MS/MS

傳統(tǒng)中藥玄參(Radix Scrophulariae)是玄參科植物浙玄參ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根[1]，性微寒，味甘、苦、咸，歸肺、胃、腎經(jīng)；具有涼血滋陰、瀉火解毒的功效[2]。玄參中主要含有環(huán)烯醚萜苷和苯丙素苷等[3-4]，具有鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌、保肝、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血壓、神經(jīng)保護(hù)等作用[5-7]。玄參中測(cè)定哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸、安格洛苷C的HPLC法已有報(bào)道[8]，但用HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定玄參中梓醇、哈巴苷、梔子苷、類葉升麻苷、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、5-羥甲基糠醛8個(gè)成分的含量未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立具有高靈敏度、高選擇性的HPLC-MS/MS法對(duì)玄參中這8個(gè)成分進(jìn)測(cè)定，并測(cè)定了不同產(chǎn)地玄參藥材的8個(gè)成分的含量，為全面控制玄參質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1材料

9批次玄參(產(chǎn)自重慶秀山，河北，四川北川、雅安、巫山、寶興，貴州、河南、湖南)經(jīng)四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院黎躍成主任藥師鑒定為玄參正品。

1.2儀器

高效液相色譜儀-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent1290-6460，MussHunter工作站)；SartoriusCPA225D型電子天平；Milli-Q超純水儀；超聲儀(上海冠特超聲儀器公司)。

1.3試劑與對(duì)照品

1.3.1試劑 甲醇、超純水。

1.3.2對(duì)照品 梓醇(批號(hào)：110808-200508，99.5%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，哈巴苷(批號(hào)：Must-12121902，≥95%)、梔子苷(批號(hào)：Must-13041809，≥95%)、類葉升麻苷(批號(hào)：Must-13051002，≥95%)、安格洛苷C(批號(hào)：Must-13051502，≥95%)、肉桂酸(批號(hào)：Must-12123102，≥95%)、哈巴俄苷(批號(hào)：Must-12071801，≥95%)、5-羥甲基糠醛(5-HMF)(批號(hào)：Must-12110805，≥95%)購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱定梓醇、哈巴苷、梔子苷、類葉升麻苷、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、5-羥甲基糠醛(5-HMF)對(duì)照品適量，分別置棕色量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至各量瓶中，得單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述各儲(chǔ)備液適量，用50%甲醇水配制成混合對(duì)照品中間液，質(zhì)量濃度為梓醇38.8μg·mL-1、哈巴苷54.75μg·mL-1、梔子苷78.8μg·mL-1、類葉升麻苷55.9μg·mL-1、安格洛苷C61.9μg·mL-1、肉桂酸17.4μg·mL-1、哈巴俄苷52.9μg·mL-1、5-羥甲基糠醛6.85μg·mL-1，備用。

2.2供試品溶液的制備

取各玄參，粉碎(過(guò)三號(hào)篩)，稱取粉末，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇水溶液50mL，稱重，放置30min，超聲處理45min(功率300W，頻率45kHz)，放冷，再稱重，用50%甲醇水溶液補(bǔ)足減失的重量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，過(guò)0.22μm微孔濾膜，即得。

2.3色譜條件

色譜柱：AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：0.05%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～5min，60%～60%A；5～8min，60%～40%A；8～19min，40%～20%A；19～19.1min，20%～60%A；19.1～22min，60%～60%A)；流速：0.6mL·min-1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：2μL。

2.4質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式，干燥氣流速：7.0L·min-1，干燥氣溫度：300℃；毛細(xì)管電壓：3500V，四級(jí)桿溫度：100℃，檢測(cè)化合物離子參數(shù)見表1，對(duì)照品及玄參樣品的MRM總離子流圖見圖1，各化合物的提取色譜圖見圖2。

2.5線性關(guān)系及檢測(cè)下限考察

取2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品中間液適量，用50%甲醇水溶液稀釋成系列混合對(duì)照品溶液(每個(gè)化合物至少測(cè)定5個(gè)濃度水平)，照上述方法進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以對(duì)照品濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程。同時(shí)以信噪比(S/N)3∶1及10∶1為基準(zhǔn)分別測(cè)定各化合物的檢出限及定量限，結(jié)果見表2；結(jié)果表明各化合物在下列質(zhì)量濃度(見表2)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限在5～50 ng·mL-1，定量限在17～167 ng·mL-1。

表1 檢測(cè)化合物離子參數(shù)

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下制備的供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、4、8、12、48 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄其峰面積。結(jié)果各時(shí)間段梓醇、哈巴苷、梔子苷、類葉升麻苷、安格洛苷C、肉桂酸、哈巴俄苷、5-羥甲基糠醛峰面積的RSD分別為2.11%、1.95%、2.22%、3.91%、2.15%、1.44%、1.64%、4.01%，表明供試品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)定含量的玄參樣品(樣品編號(hào)1)粉末約0.1g，共9份，分別精密加入低、中、高3個(gè)水平的單一對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度3份，按2.2項(xiàng)下制備加樣回收率測(cè)定樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各化合物的平均回收率，結(jié)果見表3?；厥章试?1.33%～99.78%，RSD%小于5.3%，表明準(zhǔn)確度良好。

2.8樣品含量測(cè)定

取各個(gè)玄參樣品約0.2g，精密稱定，按2.2項(xiàng)下供試品溶液方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

圖2 玄參中8個(gè)化合物的提取色譜圖

成分回歸方程r線性范圍/μg·mL-1檢出限/ng·mL-1定量限/ng·mL-1類葉升麻苷Y=359.7X+77.80.99740.2795～16.7750167哈巴俄苷Y=1804.8X-259.10.99980.2645～31.7410335-HMFY=70989.4X+1671.70.99920.0343～1.3700517哈巴苷Y=12871.1X-1856.30.99980.2738～32.851033肉桂酸Y=58021.8X+964.60.9991 0.087～5.220827梔子苷Y=4142.0X+828.90.9964 0.394～23.6440133安格洛苷CY=825.6X-148.20.99940.3095～12.3830100梓醇Y=1125.9X-91.30.99900.1940～7.76 2067

表3 玄參中8種化合物的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

表3(續(xù))

表4 不同來(lái)源玄參中8個(gè)成分含量 /mg·g-1

3 討論

3.1 HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定玄參中8個(gè)成分較HPLC法的優(yōu)勢(shì)

玄參藥材中含有多種成分，雜質(zhì)較多，用HPLC法測(cè)定8個(gè)成分[9]，色譜分離難度較大，如果強(qiáng)行分離，分析時(shí)間會(huì)長(zhǎng)達(dá)50 min以上，并且選擇性較HPLC-MS/MS法差；如果加上過(guò)多凈化步驟，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)，容易造成損失，回收率下降，用HPLC-MS/MS法可以同時(shí)分析玄參中8個(gè)成分，提取離子流圖幾乎看不到任何其他物質(zhì)的干擾，分析時(shí)間短(22 min內(nèi))，回收率高，適用于上述成分的同時(shí)測(cè)定。

3.2質(zhì)譜條件的選擇

化合物在質(zhì)譜中以[M+Na]+或[M+NH4]+存在，在甲酸作用下，供試液呈酸性，正模式下，有助樣品離子化。對(duì)甲酸濃度(0.05%、0.1%、0.2%)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)靈敏度差距不大，最終選擇甲醇-0.05%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

3.3提取條件的優(yōu)化

考察不同提取溶劑(甲醇、70%甲醇水、50%甲醇水、30%甲醇水、水)、不同提取方式(加熱回流、超聲)及提取時(shí)間(10、20、30、45、60min)和提取次數(shù)(1、2、3次)，最終確定稱取藥材粉末0.2g、用50%甲醇水溶液提取45min、50mL分兩次提取為最佳提取條件。

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SimultaneousDeterminationofEightComponentsinRadixScrophulariaebyHPLC-MS/MS

ZHOU Jia1*，QI Hongyi2

(1.SichuanInstituteforFoodandDrugControl,Chengdu611731，China; 2.SouthwestUniversity,Chongqing400715，China)

Objective：To establish a method for simultaneous determination of eight components in Radix Scrophulariae including catalpol，harpagoside，geniposide，acteoside，angoroside C，cinnamic acid，harpagide，5-HMF.Methods：Chromatographic separation was performed on an Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 column (150 mm × 4.6 mm，5 μm) at 30 ℃ of column temperature.0.05% aqueous formic acid (A) and methanol (B) were adopted as mobile phase with a gradient elution.The flow rate was set at 0.6 mL·min-1.The injection volume was 2 μL.Detection was carried out on a triple quadrupole mass spectrometer in the positive ion mode using an electrospray source.Multiple reaction monitoring(MRM) mode was employed.Results：The developed method showed good linearity in the range of 0.194 0-7.76 μg·mL-1(r=0.999 0) for catalpol，0.173 8-32.85 μg·mL-1(r=0.999 8) for harpagoside，0.394-23.64 μg·mL-1(r=0.996 4) for geniposide，0.279 5-16.77 μg·mL-1(r=0.9974) for acteoside，0.309 5-12.38 μg·mL-1(r=0.999 4) for angoroside C，0.087-5.220 μg·mL-1(r=0.9991) for cinnamic acid，0.264 5-31.74 μg·mL-1(r=0.999 8) for harpagide，0.034 3-1.370 0 μg·mL-1(r=0.999 2) for 5-HMF，respectively.The limit of detection was 5-50 ng·mL-1.The recoveries varied between 91.33%-99.78%.Harpagide，harpagoside and angoroside C were found to be the most abundant components in Radix Scrophulariae.There were significant differences in distribution of these components among the samples from different origins.Conclusion：The established method of determination of 8 kinds of component content in Radix Scrophulariae within 22 min is proved to be accurate and sensitive.The experimental results can provide reference for the quality of Radix Scrophulariae.

Radix Scrophulariae；catalpol；harpagoside；geniposide；acteoside；angoroside C；cinnamic acid；harpagide；5-HMF；HPLC-MS/MS

重慶市科技人才培養(yǎng)(創(chuàng)新青年科技人才培養(yǎng))項(xiàng)目(cstc2013kjrc-qnrc10002)

] 周佳，主管藥師，碩士，研究方向：食品藥品檢驗(yàn)；E-mail：275946785@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.015

2016-12-30)

*[