張繼丹，李化*，柯華香，邵愛娟，楊濱

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；2.道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700；3.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

·中藥工業(yè)·

離子液體超聲提取五味子木脂素的工藝研究△

張繼丹1，2，李化1，2*，柯華香1，3，邵愛娟1，2，楊濱1，2

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；2.道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700；3.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

目的：研究離子液體超聲提取五味子木脂素的最佳提取工藝。方法：以五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量為指標(biāo)，分別考察離子液體種類、濃度、料液比、提取溫度和超聲時間對提取效果的影響，得出最佳提取工藝參數(shù)；將所得的最佳提取工藝與超聲提取法和回流提取法比較。結(jié)果：五味子木脂素的最佳提取工藝為以0.4 mol·L-1的溴化1-丁基-3-甲基咪唑[C12MIM][Br]為提取溶劑，料液比1∶30，溫度30 ℃，超聲提取10 min時，效果最佳。結(jié)論：離子液體超聲提取法簡便快速，可用于五味子中木脂素的快速提取。

離子液體；五味子；木脂素成分；提取方法

離子液體(Ionic liquids，ILs)主要由有機(jī)陽離子和無機(jī)陰離子組成，是在室溫或接近室溫(低于100 ℃)下呈液體狀態(tài)的熔融鹽[1]。與常見的有機(jī)溶劑相比，離子液體的蒸汽壓低、揮發(fā)性弱、穩(wěn)定性好，不易燃易爆；同時，離子液體具有可調(diào)節(jié)性，能根據(jù)所提化合物的特點(diǎn)，選擇合適的陰、陽離子。由于離子液體超聲提取法具有所需設(shè)備價格低廉、操作簡便、提取時間短、溶劑用量少等特點(diǎn)，目前已有離子液體用于中藥中生物堿[2]、黃酮[3]、皂苷[4]等成分的提取報道，并得到了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

中藥五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功能，用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻等病癥的治療[5]。中藥五味子中的化學(xué)成分有木脂素、揮發(fā)油、多糖等，其中木脂素類成分是其主要化學(xué)成分[6]，也是2015版《中華人民共和國藥典》評價五味子質(zhì)量的指標(biāo)成分。文獻(xiàn)報道的提取五味子中木脂素的方法有回流提取[7]、超高壓水射流提取[8]、微波提取[9]、閃式提取[10]、超臨界提取[11]以及高壓脈沖電場提取[12]等，這些方法大多采用揮發(fā)性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑，易對人體健康和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不利影響，且部分提取技術(shù)采用高壓設(shè)備，存在成本昂貴等問題。本研究擬以離子液體為提取溶劑，采用超聲法對五味子中木脂素的提取工藝進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器

WatersACQUITYH-ClassUPLCTM超高效液相色譜儀(包括四元溶劑系統(tǒng)、真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、EmpowerⅡ色譜工作站)；Milli-Q型超純水制備儀(法國Millipore公司)；Eppendorf離心機(jī)；ScoutPro型電子天平(美國Ohaus公司)；2004MP6型半微量電子顯示天平(德國Sartorius公司)；KQ-100DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(功率：100W，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥

溴化1-丁基-3-甲基咪唑[C4MIM][Br]、溴化1-己基-3-甲基咪唑[C6MIM][Br]、溴化1-辛基-3-甲基咪唑[C8MIM][Br]、溴化1-癸基-3-甲基咪唑[C10MIM][Br]和溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑[C12MIM][Br](上海成捷化學(xué)品公司)；五味子醇甲(批號MUST-13061206，純度≥98%)、五味子醇乙(批號MUST-14010312，純度≥98%)、五味子酯甲(批號MUST-13110606，純度≥98%)、五味子甲素(批號MUST-13080205，純度≥98%)、五味子乙素(批號MUST-13091606，純度≥98%)(成都曼思特生物科技有限公司)；乙腈和甲醇為色譜純(美國Fisher公司)；其他試劑均為分析純；超純水由Mili-Q純水機(jī)制備。

五味子藥材購自北京同仁堂藥店，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所楊濱研究員鑒定為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz) Baill.的干燥成熟果實(shí)。藥材粉碎過40目篩。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為AquityBEHC18(50mm×2.1mm，1.7μm)；檢測波長為235nm；柱溫為45 ℃；流動相為水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫見表1[13]；進(jìn)樣量為1μL；流速為0.4mL·min-1，對照品和樣品的色譜圖見圖1。

表1 洗脫梯度

注：A.木脂素混合對照品；B.樣品溶液；1.五味子醇甲；2.五味子醇乙；3.五味子酯甲；4.五味子甲素；5.五味子乙素。圖1 木脂素混合對照品、樣品溶液的UPLC圖

2.2對照品溶液的制備

取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素適量，精密稱定，用甲醇溶解，制成上述5種成分的濃度分別為0.2216、0.1012、0.0202、0.0849、0.1656mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3離子液體超聲輔助提取工藝優(yōu)化

考察離子液體種類、離子液體濃度、超聲溫度、提取時間和料液比對五味子中5種木脂素含量和總木脂素含量(5種木脂素各含量之和)的影響，各因素水平見表2。

表2 提取工藝因素與水平

2.3.1 離子液體種類對提取效果的影響 以Br-1為陰離子的離子液體具有化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、提取率高等特性[14]，因此本文將Br-1作為陰離子，著重考察陽離子種類對提取效果的影響。

取五味子粉末0.2 g，精密稱定，準(zhǔn)確加入不同種類的離子液體(濃度為0.4 mol·L-1)4 mL，30 ℃超聲30 min，離心10 min (4000 r·min-1)，濾過(0.2 μm)，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計算各樣品中木脂素的含量，考查離子液體種類[C4MIM][Br]、[C6MIM][Br]、[C8MIM][Br]、[C10MIM][Br]和[C12MIM][Br]對5種木脂素提取率的影響。結(jié)果見圖2。

圖2 離子液體種類對提取率的影響

由圖2可知，在離子液體種類考察范圍內(nèi)，隨著離子液體烷烴鏈的延長，5種木脂素類成分的提取率呈增長趨勢，當(dāng)使用[C12MIM][Br]為提取溶劑時，各成分含量最高，故確定最佳離子種類為[C12MIM][Br]。

2.3.2 離子濃度對提取效果的影響 取五味子粉末0.2 g，精密稱定，以[C12MIM][Br]為提取溶劑，準(zhǔn)確加入不同濃度離子液體溶液4 mL，在30 ℃下超聲30 min，離心10 min(4000 r·min-1)，濾過(0.2 μm)，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計算各樣品中木脂素的含量，考察離子濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 mol·L-1時，對5種木脂素類成分提取率的影響。結(jié)果見圖3。

注：五味子乙素采用右側(cè)坐標(biāo)軸，其余采用左側(cè)坐標(biāo)軸。圖3 離子液體濃度對提取效果的影響

由圖3可知，隨著離子液體濃度的增大，各木脂素的提取率曲線整體呈先增長后平緩的趨勢，在濃度為0.4 mol·L-1時，各木脂素提取率最高，因此確定最佳離子液體濃度為0.4 mol·L-1。

2.3.3 料液比對提取效果的影響 取五味子粉末0.2 g，精密稱定，以0.4 mol·L-1的[C12MIM][Br]為提取溶劑，準(zhǔn)確加入不同料液比的該溶劑，在30 ℃下超聲30 min，離心10 min(4000 r·min-1)，濾過(0.2 μm)，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計算各樣品中木脂素的含量，考察料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50時，對5種木脂素提取率的影響。結(jié)果見圖4。

注：五味子酯甲采用右側(cè)坐標(biāo)軸，其余采用左側(cè)坐標(biāo)軸。圖4 料液比對木脂素類成分的影響

由圖4可知，除五味子酯甲外，剩余的4種成分的提取率變化均先增長后平緩趨勢，當(dāng)料液比為1∶30時，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子總木脂素均達(dá)到最大值，由于五味子酯甲含量提取率較低，對于總木脂素提取率影響不明顯，故選擇最佳料液比為1∶30。

2.3.4 溫度對提取效果的影響 取五味子粉末0.2 g，精密稱定，準(zhǔn)確加入0.4 mol·L-1的[C12MIM][Br]6 mL，在不同溫度下超聲30 min后，離心10 min(4000 r·min-1)，濾過(0.2 μm)，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計算各樣品中木脂素的含量，考察提取溫度分別為20、30、40、50、60 ℃時，對5種木脂素提取率的影響。結(jié)果見圖5。

注：五味子酯甲采用右側(cè)坐標(biāo)軸，其余采用左側(cè)坐標(biāo)軸。圖5 提取溫度對提取效果的影響

由圖5可知，從整體趨勢上，溫度變化對5種木脂素類成分的提取效果無明顯影響。但也可以觀察到溫度從20 ℃變化至30 ℃時，各木脂素類成分的提取率微呈上升趨勢；而30 ℃升高到60 ℃時，各成分提取率趨勢無明顯變化；因此，確定最佳提取溫度為30 ℃。

2.3.5 提取時間對提取效果的影響 取五味子粉末0.2 g，精密稱定，準(zhǔn)確加入0.4 mol·L-1的[C12MIM][Br]溶液6 mL，在30 ℃下，超聲不同時間后，離心10 min(4 000 r·min-1)，濾過(0.2 μm)，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計算各樣品中木脂素的含量，考察提取時間為10、20、30、40、50 min對5種木脂素提取率的影響。結(jié)果見圖6。

注：五味子酯甲采用右側(cè)坐標(biāo)軸，其余采用左側(cè)坐標(biāo)軸。圖6 提取時間對提取效果的影響

由圖6知，在考察時間范圍內(nèi)，5種木脂素提取率曲線變化平緩，為提高效率，選擇10 min為最佳提取時間。

2.3.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 綜上所述，確定五味子木脂素的最佳提取工藝：離子液體種類[C12MIM][Br]，離子液體濃度0.4 mol·L-1，溫度30 ℃，提取時間10 min，料液比1∶30，提取效果最佳。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子總木脂素含量的RSD值均小于5%。結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) %

2.4 不同方法提取五味子中5種木脂素類成分的比較

采取超聲提取法(《中華人民共和國藥典》法)[9]和回流提取法[15]對五味子木脂素進(jìn)行提取，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與離子液體超聲提取結(jié)果進(jìn)行比較。

2.4.1 超聲提取法(藥典法) 取五味子粉末0.25 g，精密稱定，加入甲醇20.0 mL，稱定重量。在室溫條件下超聲(功率100 W，頻率20 kHz)處理20 min，放冷，補(bǔ)足減失重量，濾過(0.2 μm)，按2.1項(xiàng)的色譜條件測定，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計算各樣品中木脂素的含量。結(jié)果見表4。

2.4.2 回流提取法 精密稱取五味子藥材粉末1 g，加入80%乙醇12.0 mL，回流提取兩次，每次提取3 h，合并兩次續(xù)濾液，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用80%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過(0.2 μm)，按2.1項(xiàng)的色譜條件測定，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計算各樣品中木脂素的含量。結(jié)果見表4。

表4 3種提取方法比較 %

2.4.3 不同提取方法結(jié)果比較 由表4可知，離子液體超聲提取法的提取效果與超聲提取法和回流法的提取效果相近，但其提取時間短，僅需10 min，可快速提取五味子中木脂素成分，且所用離子液體綠色環(huán)保，可重復(fù)利用。

3 討論

有效成分提取效率受到溶劑種類、粘度、料液比和溫度等多種因素的影響。本研究中采用的離子液體其極性隨著陰離子烷基鏈的增長而減小，其粘度與離子液體濃度呈一定正相關(guān)關(guān)系。而本文中的5種木脂素為聯(lián)苯環(huán)辛二烯類，故選擇濃度為0.4 mol·L-1的[C12MIM][Br]為宜。適宜的料液比能夠增大有效成分提取率，為減少溶劑回收工作量，所以確定最佳料液比為1∶30。提高溫度可加快分子熱運(yùn)動，由溫度-提取率曲線得出，30 ℃提取效果好。本研究發(fā)現(xiàn)，提取時間對木脂素提取效率無明顯影響，故選擇10 min。

Ma等[16]報道了以0.8 mol·L-1的[C12MIM][Br]離子液體水溶液為提取溶劑，料液比為1∶12，浸泡4.0 h后，超聲提取3次，每次30 min，五味子中木脂素的提取效果是回流提取的3.5倍。本研究采用0.4 mol·L-1的[C12MIM][Br]離子液體水溶液為提取溶劑，料液比為1∶30，在溫度30 ℃下，超聲10 min，五味子中木脂素的提取效果與回流法提取效果相當(dāng)。

在實(shí)驗(yàn)過程中，作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)[C12MIM][Br]的濃度大于0.6 mol·L-1時，離子液體粘度過大，不易溶于水中，且對色譜柱造成污染，需對樣品溶液稀釋后進(jìn)樣。

[1] Tang S，Baker G A，Zhao H.Ether-and alcohol-functionalized task-specific ionic liquids：Attractive properties and applications[J].Cheminform，2012，41(10):4030-4066.

[2] Luo J，Song H，Zhang Y W，et al.Ionic liquid-based ultrasonic-assisted extraction of berberine from rhizome of Coptis chinensis[J].Natural Products，2012，8(2)：41-49.

[3] Zhao C，Lu Z，Li C，et al.Optimization of Ionic Liquid Based Simultaneous Ultrasonic-and Microwave-Assisted Extraction of Rutin and Quercetin from Leaves of Velvetleaf (Abutilon theophrasti) by Response Surface Methodology[J].The Scientific World Journal，2014:2014:1-11.

[4] Wang P，Ma C，Chen S，et al.Ionic Liquid-Based Ultrasonic/Microwave-Assisted Extraction of Steroidal Saponins from Dioscorea zingiberensis CH Wright[J].Tropical Journal of Pharmaceutical Research，2014，13(8)：1339-1345.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[6] 史琳，王志成，馮敘橋.五味子化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展[J].藥物評價研究，2011，34(3)：208-212.

[7] 蔣益萍，張巧艷，張宏，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選五味子木脂素類成分的提取工藝[J].中成藥，2013，35(11)：2390-2394.

[8] 張小榮，徐柏三，王盛民，等.超高壓水射流對五味子中五味子醇甲含量影響的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20(11)：2684-2695.

[9] 黃天輝，沈平孃.均勻設(shè)計優(yōu)選微波萃取五味子的工藝研究[J].中成藥，2006，28(8)：1111-1113.

[10]程振玉.北五味子木脂素和多糖提取工藝研究[D].長春：東北師范大學(xué)，2014.

[11] 楊蘇蓓.超臨界流體萃取五味子中木脂素等成分的工藝研究[J].中國中藥雜志，2001，26(11)：755-757.

[12]趙景輝，王再幸，趙偉剛，等.高壓脈沖電場法快速提取北五味子中五味子醇甲的工藝研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2011，23(4)：755-757.

[13]柯華香，李化，蘇建春，等.南北五味子中木脂素類成分含量的比較[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21(17)：40-43.

[14]Sun Y，Li W，Wang J.Ionic liquid based ultrasonic assisted extraction of isoflavones from Iris Tectorum Maxim and subsequently separation and purification by high speed counter current chromatography[J].Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences，2011，879(13/14)：975-980.

[15]張明華，陳虹，李靈芝，等.五味子甲素和五味子醇甲對四氯化碳所致肝臟損傷的保護(hù)作用[J].武警醫(yī)學(xué)，2002，13(7)：395-396.

[16]Ma C，Liu T，Yang L，et al.Study on ionic liquid-based ultrasonic-assisted extraction of biphenyl cyclooctene lignans from the fruit of Schisandra chinensis Baill[J].Analytica chimica acta，2011，689(1)：110-116.

IonicLiquid-BasedUltrasonic-AssistedExtractionofLignansfromFruitofSchisandrachinensis(Turcz.)Baill.

ZHANG Jidan1，2，LI Hua1，2*，KE Huaxiang1，3，SHAO Aijuan1，2，YANG Bin1，2

(1.InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China；2.StateKeyLaboratoryBreedingBaseofDao-diHerbs，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China；3.SchoolofFoodandBioengineering，XiHuaUniversity，Chengdu610039，China)

Objective：To optimize the extraction technique of lignans fromSchisandrachinensis，using ionic liquid-based ultrasonic-assisted extraction (ILUAE).Methods：Different cations and concentration of ionic liquid，solid-liquid ratio，extraction temperature and time for ultrasonic treatment were optimized by single factor experiments in order to increase the content of schisandrin，schisandrol B，schisantherin A，deoxyschisandrin，schisandrin B.Moreover，heat-reflux extraction and ultrasonic-assisted extraction were also experimented forthe comparison.Results：The optimized operational variables of ILUAE were obtained as follows：[C12MIM]Br concentration 0.4 mol/L was selected as solvent，solid-liquid ratio was 1∶30 (m/v)，ultrasonic treatment lasted for 10 min under the temperature 30 ℃.Conclusion：ILUAE is convenient and rapid，and can be used to extract lignans fromS.chinensis.

Ionic liquid；Schisandrachinensis(Turcz.)Baill；lignans；extraction

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(201407003)

] 李化，博士，副研究員，研究方向：中藥化學(xué)與質(zhì)量評價、元素的形態(tài)分析；Tel：(010)64014411-2848，E-mail：lihua1976@icmm.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.022

2017-07-11)

*[