蘇春燕，魏江春，，胡永建，，羅毅，高微微*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，河南 鄭州 450002)

·中藥農(nóng)業(yè)·

三種根類(lèi)藥材上污染真菌的分離方法優(yōu)化△

蘇春燕1，魏江春1，2，胡永建1，3，羅毅1，高微微1*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京100193；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110016；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，河南 鄭州450002)

目的：優(yōu)化藥材上主要污染真菌的分離方法，并分析三七、柴胡和黨參的污染真菌情況。方法：采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合稀釋平板法考察藥材種類(lèi)(A)、搖床轉(zhuǎn)速(B)、振搖時(shí)間(C)和培養(yǎng)基種類(lèi)(D)對(duì)真菌總數(shù)、曲霉菌和青霉菌分離效果的影響，曲霉菌和青霉菌根據(jù)形態(tài)進(jìn)行鑒定。超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法(UPLC-MS/MS)檢測(cè)三種藥材上黃曲霉毒素(AFs)的污染情況。結(jié)果：藥材上真菌總數(shù)和曲霉菌的最優(yōu)分離條件為轉(zhuǎn)速130r·min-1，振搖時(shí)間15min，YES培養(yǎng)基；青霉菌的最優(yōu)分離條件為轉(zhuǎn)速160r·min-1，振搖時(shí)間30min，PDA培養(yǎng)基。黨參上的真菌總數(shù)高于三七和柴胡，三種藥材上曲霉菌數(shù)均高于青霉菌數(shù)。柴胡上檢測(cè)到黃曲霉毒素B1的含量為4.54μg·kg-1，三七和黨參上未檢出AFs。結(jié)論：分離條件對(duì)分離結(jié)果有一定影響，三種藥材上曲霉屬真菌的污染值得重視。

三七；柴胡；黨參；真菌總數(shù)；曲霉；青霉；正交實(shí)驗(yàn)

中藥材在生產(chǎn)、加工和儲(chǔ)藏過(guò)程中容易受到真菌污染出現(xiàn)發(fā)霉的現(xiàn)象，從而影響藥材質(zhì)量，霉菌中的曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)中的一些種可以產(chǎn)生黃曲霉毒素(AFs)、赭曲霉毒素、展青霉素、桔霉素等真菌(霉菌)毒素[1-2]，進(jìn)而影響中藥材的安全。

菌株分離是污染真菌研究中的第一個(gè)環(huán)節(jié)，在以往文獻(xiàn)報(bào)道中，中藥材表面真菌的分離多參考糧食、堅(jiān)果等振搖式分離結(jié)合稀釋平板培養(yǎng)的方法，采用搖床轉(zhuǎn)速?gòu)?0 r·min-1到130 r·min-1不等[3-4]，振搖時(shí)間從3 min到30 min不等[3，5-7]，選用的培養(yǎng)基也有所不同[8-10]，尚沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本文采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析不同的分離條件對(duì)藥材表面污染真菌，特別是青霉屬和曲霉屬真菌分離效果的影響，旨在建立根類(lèi)藥材表面真菌的適宜分離方法，為藥材上產(chǎn)毒真菌及后續(xù)的真菌毒素研究提供方法學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1供試藥材

三七和柴胡飲片，購(gòu)自河北安國(guó)市藥材交易大廳，貯藏時(shí)間為2年；黨參藥材于購(gòu)自湖北板橋縣黨參種植基地的藥材倉(cāng)庫(kù)，貯藏時(shí)間1年。3種藥材各購(gòu)買(mǎi)1kg，用無(wú)菌密封袋獨(dú)立密封，放置于室溫下，1周內(nèi)完成分離及檢測(cè)。

1.2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)藥材種類(lèi)(A)、轉(zhuǎn)速(B)、處理時(shí)間(C)和分離培養(yǎng)基(D)4個(gè)因素，每個(gè)因素各設(shè)3個(gè)水平，制定因素水平表(表1)，以真菌總數(shù)，曲霉屬和青霉屬真菌數(shù)為指標(biāo)，確定藥材上污染真菌的最佳分離方法。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L9(34)

1.3培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基(200g土豆，20g葡萄糖，15g瓊脂，1000mL蒸餾水)，MEA培養(yǎng)基(20g麥芽浸粉，20g葡萄糖，1g蛋白胨，15g瓊脂，1000mL蒸餾水)，酵母蔗糖培養(yǎng)基(YES)(20g酵母浸粉，150g蔗糖，0.5gMgSO4·7H2O，20g瓊脂，1000mL蒸餾水)，于121℃滅菌30min。

1.4真菌分離及培養(yǎng)

采用稀釋平板法進(jìn)行污染菌分離。將每種藥材充分混勻，稱取10g藥材，加入含90mL無(wú)菌水的三角瓶中，放置到搖床(ZWY-240，上海智城分析儀器制造有限公司)上，按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行不同轉(zhuǎn)速和不同振搖時(shí)間處理。振搖結(jié)束后靜置5min，將上清液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)翝舛葹?0-4。分別取原液和各濃度稀釋液1mL，接種于不同培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)。接種后的平板于25℃恒溫培養(yǎng)3d。選擇每個(gè)平板上的菌落數(shù)在10～60個(gè)范圍的濃度用于菌落計(jì)數(shù)。

1.5真菌形態(tài)學(xué)鑒定

將純化的菌株，接種于MEA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7d，觀察菌落形態(tài)和顯微形態(tài)，參考《中國(guó)真菌志》[11-12]，鑒定曲霉屬和青霉屬真菌，并分別記錄各自菌落數(shù)。

1.6黃曲霉毒素(AFs)提取及含量測(cè)定

藥材樣品于50℃烘干至恒重，粉碎。精密稱取10g藥材粉末，加入50mL85%甲醇，超聲提取30min，抽濾，濾液用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?mL甲醇溶解，于6000r·min-1離心5min，所得上清溶液用水定容到5mL后過(guò)C18柱凈化，洗脫液用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)芙庵?mL甲醇中，用0.22μm尼龍濾膜過(guò)濾，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)檢測(cè)AFs的含量。UPLC-MS/MS采用ShimadzuLC20ADXR液相色譜儀(日本島津公司)串聯(lián)5500QTRAP質(zhì)譜儀(美國(guó)ABSciex公司)。色譜柱采用ZORBAXElipseC18反相柱(50mm×2.1mm，1.8μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)，流動(dòng)相為(A)0.1%甲酸+5mmol·L-1乙酸銨水溶液-(B)0.1%甲酸乙腈，洗脫梯度為0.00～4.00min(70%～20%B)；4.00～5.00min(20%～70%B)；5.00～6.00min(70%B)，流速0.2mL·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣量5μL。質(zhì)譜條件為正離子模式，電噴霧離子源(ESI)；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；電噴霧電壓5500V；離子源溫度550℃。用于定量AFs分子的離子對(duì)信息：AFB1為m/z313.0～285.1，m/z313.0～241.3，m/z313.0～185.1；AFB2為m/z315.0～259.0，m/z315.0～287.0，m/z315.0～243.0；AFG1為m/z329.0～243.0，m/z329.0～311.0，m/z329.0～283.0；AFG2為m/z331.0～235.1，m/z331.0～257.0，m/z331.0～189.0[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1分離方法的優(yōu)化結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)污染真菌的分離效果有較大影響。對(duì)于真菌總數(shù)，極差值(R1)A>B>C>D，說(shuō)明藥材種類(lèi)(A)是影響真菌總數(shù)的決定因素，即不同藥材受污染的程度有較大差異；搖床轉(zhuǎn)速(B)次之，再次為振搖時(shí)間(C)，培養(yǎng)基(D)的影響最小(表2)。對(duì)于曲霉菌數(shù)，極差值(R2)D>C>A>B，表明培養(yǎng)基種類(lèi)和振搖時(shí)間的影響大于藥材種類(lèi)和轉(zhuǎn)速(表2)。對(duì)于青霉菌數(shù)，極差值(R3)A>D>C>B，表明藥材種類(lèi)是主要因素，培養(yǎng)基種類(lèi)次之，轉(zhuǎn)速和振搖時(shí)間的影響較小(表2)。綜合分析，確定分離藥材上總真菌和曲霉的最佳分離方法為B2C1D3，即轉(zhuǎn)速為130r·min-1，振搖時(shí)間為15min，培養(yǎng)基為YES。青霉的最佳分離方法為B3C2D1，即轉(zhuǎn)速為160r·min-1，振搖時(shí)間為30min，培養(yǎng)基為PDA。方差分析表明4個(gè)因素的影響均不顯著(表3)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2三種藥材的污染真菌對(duì)比

從三七，柴胡和黨參三種藥材樣品上均分離到真菌，真菌污染率為100%(表2)，所有樣品上的真菌總數(shù)均大于103cfu·g-1。黨參上的真菌總數(shù)多于三七和柴胡。柴胡和黨參上均分離到了曲霉屬和青霉屬真菌，且不同處理方法得到的曲霉菌數(shù)大于青霉菌數(shù)；從三七樣品上只分離到曲霉屬真菌(表2)。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

注：F(2，2)=19.0。

2.3分離方法對(duì)3種藥材分離結(jié)果的影響

將柴胡的3個(gè)處理組(4、5、6)進(jìn)行對(duì)比，真菌總數(shù)、曲霉菌數(shù)和青霉菌數(shù)在不同處理組間的差異較大(表2)，說(shuō)明柴胡上的真菌分離結(jié)果受分離方法的影響較大；黨參的情況也類(lèi)似。然而三七的不同處理組間分離到的真菌總數(shù)和曲霉菌數(shù)差異較小，說(shuō)明分離方法對(duì)三七表面真菌分離的結(jié)果影響較小。可能是三七表面較光滑，且質(zhì)地堅(jiān)硬，真菌孢子一般被局限在藥材表面，且容易脫落，搖床轉(zhuǎn)速和振搖時(shí)間的改變對(duì)污染真菌的分離效果影響較小。

2.4三種藥材上AFs的含量

從柴胡樣品上檢測(cè)到黃曲霉毒素B1(AFB1)，含量為4.54μg·kg-1，未檢測(cè)到黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)和黃曲霉毒素G2(AFG2)；三七和黨參樣品上均未檢出以上4種毒素。

3 討論

根類(lèi)藥材飲片一般表面粗糙，結(jié)構(gòu)上木質(zhì)纖維多，有較大的間隙，附著的真菌孢子往往不容易被分離。本實(shí)驗(yàn)選擇三七、柴胡和黨參等3種表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同的根類(lèi)藥材，采用正交實(shí)驗(yàn)的方法，優(yōu)化藥材上污染真菌的分離條件，并考察藥材上真菌污染情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針對(duì)真菌總數(shù)、曲霉菌數(shù)和青霉菌數(shù)，各因素對(duì)分離結(jié)果的影響大小順序不同。對(duì)于真菌總數(shù)和青霉菌來(lái)說(shuō)，藥材種類(lèi)為主要影響因素，說(shuō)明污染真菌受寄主影響較大；對(duì)于曲霉菌來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基種類(lèi)為主要因素，說(shuō)明曲霉屬真菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件的要求更為嚴(yán)格，張初署等[13]報(bào)道黃曲霉在高鹽分的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛，YES培養(yǎng)基因具有高糖和高鹽的特點(diǎn)，可能是中藥材上曲霉屬真菌比較好的分離培養(yǎng)基。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速及振搖時(shí)間并不是越長(zhǎng)越好，兩者的增加可能會(huì)因?yàn)榧哟罅苏婢咦优c藥材和三角瓶壁的碰撞力度，造成孢子細(xì)胞被破壞而喪失活力。

分析三種藥材上真菌污染情況，黨參的三個(gè)處理得到的真菌總數(shù)最多，這可能跟藥材來(lái)源于湖北，經(jīng)過(guò)夏季高溫高濕的貯藏條件及質(zhì)地有關(guān)。本文中三七上的優(yōu)勢(shì)屬為曲霉屬，宋美芳等[14]報(bào)道三七在西雙版納儲(chǔ)藏6個(gè)月后的優(yōu)勢(shì)屬為擬青霉屬(Paecilomyces)；王文麗等[5]從黨參上只分離到一株散囊屬真菌(Eurotium)和一株青霉屬真菌；以上文獻(xiàn)中的結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，可能與藥材的采集地，及貯藏的條件不同有關(guān)。柴胡上污染真菌的情況以往未見(jiàn)報(bào)道。

三種藥材的毒素測(cè)定結(jié)果表明，僅柴胡上檢測(cè)到含AFB1(4.54μg·kg-1)，以往也有研究者[15-16]檢測(cè)到柴胡上有AFB1污染，且污染水平大于10μg·kg-1，本文在三七上未檢測(cè)到AFs，與鄭榮等[17]的結(jié)果一致；在黨參上未檢測(cè)到AFs污染，與郝愛(ài)魚(yú)等[18]的結(jié)果一致，而譚婧等[19]曾檢測(cè)到黨參上有AFG2的污染，達(dá)到為471μg·kg-1。結(jié)合藥材上真菌污染情況，雖然黨參上真菌總數(shù)和曲霉菌數(shù)較多，卻沒(méi)有檢測(cè)到AFs，原因是AFs主要來(lái)源于曲霉屬中的黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)，而本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離的真菌沒(méi)有鑒定到種，黨參上分離得到的曲霉菌可能不是產(chǎn)毒菌，但不排除產(chǎn)毒菌的存在。柴胡上的AFs污染需要引起重視，應(yīng)該加強(qiáng)產(chǎn)毒菌的相關(guān)研究。在接下來(lái)的工作中，需要對(duì)得到真菌做進(jìn)一步種水平上的鑒定。

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OptimizationofIsolationMethodofContaminationFungionThreeRootMedicinalHerbs

SU Chunyan1，WEI Jiangchun1，2，HU Yongjian1，3，LUO Yi1，GAO Weiwei1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica，ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110001，China；3.InstituteofAgriculturalQualityStandardsandTestingTechnology，HenanAcademyofAgriculturalSciences，Zhengzhou450002，China)

Objective：To obtain the optimal condition of isolation method of contamination fungi from medicinal herbs，and compare the contaminated fungi onPanaxpseudoginseng，Astragalusmembranaceus，andCodonopsispilosula.Methods：According to the orthogonaltest L9(34)，the effect of four factors including herb species (A)，shaking speed (B)，shaking time (C) and medium (D) on the fungal counts of total fungi，AspergillusandPenicilliumwere measured by using the dilution plating method.All isolates ofAspergillusandPenicilliumwere identified based on morphological criteria using macro- and micro-characters.The root samples were further tested for aflatoxins using UPLC-MS/MS.Results：The optimal isolation method for both total fungi andAspergilluswas 130 r·min-1of shaking speed，15 min of shaking time，and YES medium.The optimal isolation method forPenicilliumwas 160 r·min-1of shaking speed，30 min of shaking time，and PDA medium.The fungal count of total fungi onC.pilosulawas higher than that of the other two root medicinal herbs.Moreover，the fungal count ofAspergilluson three root medicinal herbs were higher than that ofPenicillium.With respect of aflatoxins occurrence，A.membranaceuswas contaminated with AFB1at concentration of 4.54 μg·kg-1，while no AFs were detected fromP.pseudoginsengandC.pilosula.Conclusion：The isolation method affected fungi isolation results.The contamination of three herbs withAspergillusshould be paid more attention.

Panaxpseudoginseng；Astragalusmembranaceus；Codonopsispilosula；fungal count；Aspergillus；Penicillium；orthogonal test

國(guó)家自然科學(xué)基金(81274071和81473345)；國(guó)家中藥標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目(ZYBZH-Y-JIN-34)

] 高微微，研究員，研究方向：中藥質(zhì)量與安全、中藥資源生態(tài)、藥用植物病理；Tel：(010)57833423，E-mail：wwgao411@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.019

2017-02-13)

*[