王建中，徐逸，劉鵬程，陳浩波

欖香烯脂質(zhì)體結(jié)合超聲空化技術(shù)對(duì)裸鼠異位瘤的抑制作用及毒性評(píng)價(jià)

王建中1，徐逸2，劉鵬程1，陳浩波1

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥劑科，浙江 溫州 325015）

目的：以欖香烯脂質(zhì)體（EL）作為對(duì)照藥物，評(píng)價(jià)EL結(jié)合超聲空化技術(shù)在抗腫瘤療效及降低不良反應(yīng)中的作用。方法：建立大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞裸鼠皮下腫瘤模型并通過(guò)尾靜脈注射方式給藥，EL（濃度為 5 mg/mL）給藥劑量為50 mg/kg（0.1 mL/10 g）。實(shí)驗(yàn)分5組（n=7）：0.9%氯化鈉溶液（空白對(duì)照）組、欖香烯

脂質(zhì)體（EL）組、欖香烯脂質(zhì)體+超聲造影劑（EL+MB）組、欖香烯脂質(zhì)體+超聲（EL+US）組、欖香烯脂質(zhì)體+ 超聲造影劑+超聲（EL+MB+US）組，每隔2 d給藥1次，共給藥3次，檢測(cè)裸鼠腫瘤體積變化、腫瘤質(zhì)量變化、體質(zhì)量變化和血液白細(xì)胞數(shù)等指標(biāo)，取腫瘤組織，HE染色觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化，TUNEL試劑盒檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡程度，觀察超聲造影劑聯(lián)合超聲對(duì)EL抗腫瘤的療效與血液學(xué)毒性的影響。結(jié)果：與EL組比，EL+MB+US組對(duì)腫瘤體積增長(zhǎng)的抑制作用強(qiáng)（P＜0.05），裸鼠體質(zhì)量變化小，腫瘤細(xì)胞凋亡程度增加，白細(xì)胞數(shù)降低量減?。≒＜0.05）。結(jié)論：與EL相比，EL+MB+US可以更有效地發(fā)揮對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，提高裸鼠生存質(zhì)量，降低血液學(xué)毒性，可以作為一個(gè)新的腫瘤藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究。

欖香烯脂質(zhì)體；超聲；空化效應(yīng)；藥效學(xué)

欖香烯（elemene）是以β-欖香烯為主要成分，并含有少量γ-和δ-欖香烯及其他萜類(lèi)化合物[1]。欖香烯脂質(zhì)體（elemene liposome，EL）（注射液、口服乳）由于具有一定的靶向性和緩釋性，提高了生物利用度，在一定程度上提高了欖香烯的安全性和治療效率，因此替代了最初的欖香烯普通注射劑型，可是仍然存在藥物用量大、注射液對(duì)靜脈刺激產(chǎn)生炎癥、口服生物利用度低等問(wèn)題[2]。低頻（1 MHz） 超聲可有效發(fā)揮微泡（microbubbles，MB）的空化效應(yīng)，超聲定位空化技術(shù)可促進(jìn)腫瘤組織藥物吸收、提高靶向性及克服耐藥性[3-4]。本研究主要是建立裸鼠腫瘤模型，以EL為對(duì)照，評(píng)價(jià)EL結(jié)合超聲空化技術(shù)的體內(nèi)抗腫瘤療效，同時(shí)初步評(píng)價(jià)其對(duì)裸鼠的不良反應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品、試劑和細(xì)胞株：EL為大連金港制藥有限公司產(chǎn)品，脂質(zhì)MB由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院贈(zèng)送，其他化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自美國(guó)Alfa Aesar公司。大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)試劑及耗材購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.1.2 主要儀器：超聲系統(tǒng)（Acuson Sequoia 512C，德國(guó)Siemens公司），血細(xì)胞分析儀CA 620（Medonic，瑞典Boule Medical AB公司），獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠具IVC（蘇州蘇杭器材科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞裸鼠模型的建立與分組：選取5周齡雄性裸鼠40只（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（京）2011-0012，于右側(cè)腋下位置、皮下注射方式注射大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞懸液0.2 mL（每mL細(xì)胞懸液含有大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞2×107個(gè)），無(wú)菌環(huán)境中飼養(yǎng)。隔天測(cè)量1次裸鼠瘤體積，腫瘤平均體積達(dá)到100 mm3以上時(shí)，選擇瘤體積在100 mm3左右的裸鼠35只作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。分為5組，每組7只，35只裸鼠的瘤體積值輸入Excel表格中，由大到小順序排列，在表格中計(jì)算調(diào)整，使5組裸鼠瘤體積均值接近[5]。

1.2.2 處理方法：5組裸鼠通過(guò)尾靜脈注射方式給藥，EL給藥劑量50 mg/kg（EL中藥物濃度為5 mg/ mL）。每隔2 d給藥1次，共給藥3次，具體實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置及給藥方案見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方案

1.2.3 腫瘤生長(zhǎng)抑制評(píng)價(jià)：給藥后每隔1 d測(cè)量裸鼠的瘤體積，計(jì)算腫瘤的體積相對(duì)生長(zhǎng)率，最后1次給藥后測(cè)定腫瘤最終體積，計(jì)算最終的腫瘤的體積

相對(duì)生長(zhǎng)率，然后將瘤體從裸鼠體內(nèi)剝離，稱(chēng)重，計(jì)算腫瘤的瘤重相對(duì)生長(zhǎng)率。腫瘤體積計(jì)算公式：V=（l1+l2）×（w1+w2）2/16，其中l(wèi)1和l2分別表示腫瘤的2次長(zhǎng)軸測(cè)定值，w1和w2分別表示腫瘤的2次短軸測(cè)定值。第n次給藥的腫瘤體積相對(duì)生長(zhǎng)率=[（Vn- V初始）/（V′n-V′初始）]×100%，其中V和V′分別表示各實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的腫瘤體積測(cè)量值。腫瘤總體體積相對(duì)生長(zhǎng)率=[（V最終-V初始）/（V′最終-V′初始）]× 100%，腫瘤總體重量相對(duì)生長(zhǎng)率=（W最終/W′最終）× 100%，其中W最終和W′最終分別表示各實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組最后1次給藥后的腫瘤重量測(cè)量值。

1.2.4 動(dòng)物的生存狀況評(píng)價(jià)：以體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率 作為動(dòng)物生存狀況的評(píng)價(jià)指標(biāo)，記錄給藥過(guò)程中裸 鼠的體質(zhì)量變化，計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量增長(zhǎng)率， 體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率=（W最終體質(zhì)量/W′最終體質(zhì)量）×100%，其 中W最終體質(zhì)量和W′最終體質(zhì)量分別表示各實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的裸鼠最終體質(zhì)量測(cè)量值。

1.2.5 HE染色觀察移植瘤病理及TUNEL凋亡實(shí)驗(yàn)：將備用的各組裸鼠移植瘤于體視顯微鏡下觀察，組織切成2 mm×2 mm左右小塊，放入4%甲醛中固定 24 h，經(jīng)石蠟包埋后切片，厚度為5 μm，HE染色做常規(guī)病理檢查，觀察移植瘤組織壞死程度。TUNEL凋亡檢測(cè)：取各組裸鼠移植瘤石蠟切片，按照羅氏（Roche）公司TUNEL試劑盒操作方法，脫蠟、水合→細(xì)胞通透→加TUNEL反應(yīng)液→加converter-POD→與底物DAB反應(yīng)顯色→光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)并拍照。

1.2.6 血液毒性初步評(píng)價(jià)：在處死動(dòng)物前，眼眶取血，依據(jù)CA620血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀操作說(shuō)明及指南，每只裸鼠收集20 μL全血用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，初步評(píng)估血液系統(tǒng)不良反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)分析。計(jì)量資料以形式表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C6腫瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物接種后1周左右可 見(jiàn)明顯豆粒大小腫塊，2周以上瘤體積接近100 mm3， 腫瘤處皮膚與正常部位皮膚無(wú)差異，皮下腫瘤組織呈突出隆起的結(jié)節(jié)狀，質(zhì)硬，邊緣清晰。瘤體處于腋下位置。

2.1.1 腫瘤體積相對(duì)生長(zhǎng)率測(cè)定實(shí)驗(yàn)：各實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于空白對(duì)照組每天的腫瘤體積相對(duì)生長(zhǎng)率曲線見(jiàn)圖1，從第4天開(kāi)始，除空白對(duì)照組外，各實(shí)驗(yàn)組均能明顯地不同程度抑制腫瘤的體積增長(zhǎng)；EL組、EL+MB組、EL+US組腫瘤體積相對(duì)生長(zhǎng)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示在對(duì)應(yīng)超聲強(qiáng)度及MB存在下，對(duì)EL的抗腫瘤效果并沒(méi)有影響；EL+MB+US組對(duì)腫瘤的抑制作用要強(qiáng)于EL+MB組、EL+US組和EL組 （P＜0.05）。

圖1 給藥過(guò)程中各組腫瘤體積相對(duì)生長(zhǎng)率曲線

2.1.2 腫瘤重量相對(duì)生長(zhǎng)率測(cè)定實(shí)驗(yàn)：與空白對(duì)照組比，各實(shí)驗(yàn)組均能夠顯著抑制腫瘤的重量增長(zhǎng)（P＜0.05）；EL+US組、EL+MB組與EL組比較，對(duì)腫瘤重量的抑制作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；EL+ MB+US組與EL組、EL+MB組、EL+US組比，對(duì)腫瘤重量的抑制作用顯著增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.2 動(dòng)物生存狀況

2.2.1 動(dòng)物活體外觀觀察：各實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組接種大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞后，觀察瘤體的生長(zhǎng)情況及腫瘤的生長(zhǎng)對(duì)小鼠活動(dòng)的影響發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組腫瘤增長(zhǎng)迅速，皮下腫瘤組織呈非常明顯的結(jié)節(jié)狀突起，瘤體積碩大，給小鼠的正常活動(dòng)造成了嚴(yán)重影響。盡管小鼠總的體質(zhì)量沒(méi)有下降，但是身體正常組織呈現(xiàn)一定程度的消瘦跡象。EL+MB+US組給藥后腫瘤生長(zhǎng)較空白對(duì)照組緩慢，瘤體積較小，小鼠的正?；顒?dòng)基本沒(méi)有影響，但身體正常組織由于藥物的不良反應(yīng)也呈現(xiàn)一定的消瘦跡象。

圖2 各組腫瘤重量相對(duì)生長(zhǎng)率

2.2.2 小鼠的體質(zhì)量測(cè)量與比較：在給藥結(jié)束后，對(duì)各組小鼠的體質(zhì)量進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)除空白對(duì)照組體質(zhì)量明顯增加外，各實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)了明顯的體質(zhì)量下降（P＜0.05），EL組、EL+MB組、EL+US組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），EL+MB+US組與其他實(shí)驗(yàn)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 各組給藥前后體質(zhì)量增長(zhǎng)率

2.2.3 HE染色觀察移植瘤病理及TUNEL凋亡實(shí)驗(yàn)：空白對(duì)照組由緊密堆積的腫瘤細(xì)胞組成，因腫瘤的快速生長(zhǎng)導(dǎo)致一些腫瘤壞死區(qū)，各實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織凋亡率均高于空白對(duì)照組，腫瘤組織中均出現(xiàn)廣泛的核收縮和碎片，提示發(fā)生不同程度壞死，其中EL+ MB+US組壞死程度最高，EL組、EL+MB組和EL+US組也可見(jiàn)腫瘤壞死組織，但壞死面積小于EL+MB+US組，見(jiàn)圖4。TUNEL凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)驗(yàn)證，與空白對(duì)照組相比，EL+MB+US組中腫瘤組織細(xì)胞凋亡率最高；EL組、EL+MB組和EL+US組腫瘤組織中腫瘤組織細(xì)胞凋亡率也明顯高于空白對(duì)照組，但凋亡程度此3組相差不大，見(jiàn)圖5。

2.2.4 血液系統(tǒng)不良反應(yīng)初步評(píng)價(jià)：與空白對(duì)照組比，實(shí)驗(yàn)組白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。EL+MB+US組與其他治療組比白細(xì)胞減少的程度均顯著減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖4 光鏡觀察動(dòng)物模型腫瘤細(xì)胞的壞死程度（HE，×100）

圖5 TUNEL法觀察各組腫瘤細(xì)胞凋亡（×400）

3 討論

本研究通過(guò)建立裸鼠異位瘤模型，結(jié)合物理靶向（超聲空化）技術(shù)，觀察EL的療效與不良反應(yīng)。在本課題組的前期研究中，已探索了作用于裸鼠的安全超聲參數(shù)，超聲頻率為14 MHz，超聲時(shí)間為 10 s，間隔1 s超聲3次[6]。前期體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究顯示，EL+MB+US組體外仍保留較好的抗腫瘤細(xì)胞的活性，對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）為 130.5 μg/mL，低于EL的220.8 μg/mL。

由于機(jī)體的生理特征以及腫瘤的異質(zhì)性，遞送系統(tǒng)從給藥到靶點(diǎn)發(fā)揮作用需要克服多重生理及病理屏障，包括血液腫瘤組織細(xì)胞和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等屏 障[7]。對(duì)于腦部疾病治療，需要克服血腦屏障，因此挑戰(zhàn)更大。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見(jiàn)腫瘤，治療手段有限，預(yù)后極差[8]。近年來(lái)為克服藥物遞送屏障提出的很多新思路與新方法，為設(shè)計(jì)克服腫瘤生理病理屏障的遞送系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的有效遞送和腫瘤的高效安全治療也有很多理論和實(shí)踐參考，超聲空化技術(shù)因?yàn)槠浒踩院途珳?zhǔn)定位性得到研究者重視，近年來(lái)取得較多進(jìn)展[10-11]。欖香烯本身存在非水溶性、穩(wěn)定性差、生物利用度低等缺點(diǎn)，近些年科研工作者嘗試研制多種新型欖香烯制劑，以期開(kāi)發(fā)出更多可以應(yīng)用于臨床、安全性好、治療疾病類(lèi)型廣、治療效率高的欖香烯新型制劑[2-3]。

本研究成功建立了人大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞皮下接種裸鼠腫瘤模型，通過(guò)裸鼠腫瘤體積變化、腫瘤重量變化、體質(zhì)量變化和血液中白細(xì)胞數(shù)等指標(biāo)的檢測(cè)，考察了EL+MB+US與EL在治療腫瘤中的差異，發(fā)現(xiàn)EL+MB+US相比單純EL可以提高治療效果，改善動(dòng)物生存質(zhì)量。

EL+MB+US對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞接種的皮下腫瘤模型顯示了很強(qiáng)的腫瘤抑制作用，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未觀察到明顯的EL相關(guān)不良反應(yīng)。分析其原因推斷如下：首先，本研究選擇低強(qiáng)度超聲，單純超聲對(duì)于腫瘤細(xì)胞孔徑影響較小，不能促進(jìn)EL進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，而MB在超聲作用下爆破，增強(qiáng)了空化效應(yīng)，促進(jìn)了EL進(jìn)入腫瘤細(xì)胞；其次，MB中的所含成分泊洛沙姆本身也具有一定的生物效應(yīng)[12]，具有一定的增敏作用，在腫瘤組織內(nèi)部可在一定程度上抑制細(xì)胞外排泵的外排，這可能由于在MB爆破后體現(xiàn)出這種作用，單純MB發(fā)揮作用不明顯；此外，研究發(fā)現(xiàn)泊洛沙姆具有調(diào)節(jié)凋亡信號(hào)的能力[6]，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。總而言之，EL+MB+US可以有效地提高腫瘤的治療效率，超聲結(jié)合微泡對(duì)于腫瘤靶向治療具有研究意義。

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（本文編輯：趙翠翠）

Evaluation of the inhibitory action and toxicity of elemene liposome combining ultrasound cavitation on the ectopic tumor of the nude mice model

WANG Jianzhong1, XU Yi2, LIU Pengcheng1, CHEN Haobo1.
1.Department of Oncology, Wenzhou Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University, Wenzhou, 325000; 2.Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To evaluate the inhibitory action and toxicity of elemene liposome (EL) combining ultrasonic cavitation on the entopic tumor for the nude mice model. Methods: The inhibitory efficacy was studied using C6 cells bearing armpit tumor model. Mice were assigned to 5 groups (n=7) as follows: group 1 for saline, group 2 for EL, group 3 for EL+MB, group 4 for EL+US and group 5 for EL+MB+US. Mice were administered via tail vein at the dosage of 50 mg/kg amount to 0.1 mL/10 g (injection solution/mice weight), 1 time per 2 d, 3 times in all. Tumor volume, tumor weight change, body weight growth rate were all measued. The white blood cell count (WBC) at the end point was also tested. Results: Compared with EL, EL+MB+US showed higher tumor growth inhibition, fewer mice body weight change and white blood count change (P＜0.05) in the armpit tumor model. Conclusion: With better anti-tumor activity and lower blood toxicity, EL+MB+US may be developed as a new cancer targeted delivery system.

elemene liposome; ultrasound; cavitation effect; pharmacodynamics

R739.41

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.08.005

2016-09-15

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014ZB112）。

王建中（1971-），男，浙江溫州人，主任醫(yī)師，碩士。