陽(yáng) 宇，杜曉華，劉 影，鄭細(xì)閏，鄭廣娟

甲狀腺乳頭狀癌中B-raf基因V600E突變的檢測(cè)方法對(duì)比分析

陽(yáng) 宇，杜曉華，劉 影，鄭細(xì)閏，鄭廣娟

甲狀腺腫瘤；乳頭狀癌；B-raf；V600E

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，女性多于男性，約90%甲狀腺癌為甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)[1]。近年，甲狀腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，B-raf基因與PTC密切相關(guān)，最多見的突變位點(diǎn)為V600E，是目前分析和檢測(cè)的熱點(diǎn)[2]。本文回顧性分析136例PTC的B-raf基因V600E突變，并采用免疫組化Ventana BenchMark法和RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)，分析兩種方法的一致性，探討在未能開展基因檢測(cè)的醫(yī)院?jiǎn)为?dú)行免疫組化法檢測(cè)的可行性和必要性。

1 材料與方法

1.1材料選取2016年4月～11月廣東省中醫(yī)院病理科診斷的136例PTC組織，所有標(biāo)本均同步行B-raf基因V600E突變的免疫組化法染色和RT-PCR檢測(cè)。

1.2試劑DNA提取試劑盒(廣州寶創(chuàng)公司)；人類B-raf基因V600E突變檢測(cè)試劑盒(武漢海吉力公司)；超微量分光光度計(jì)ND-8000(Thermo Scientific公司)；RT-PCR檢測(cè)儀(ABI公司)。石蠟包埋組織切片機(jī)、全自動(dòng)染色機(jī)(Leica公司)；羅氏診斷B-raf V600E(VE1)抗體；全自動(dòng)免疫組化儀(Ventana BenchMark)。

1.3方法

1.3.1免疫組化染色 常規(guī)2～3 μm厚切片，運(yùn)用Ventana BenchMark全自動(dòng)免疫組化儀進(jìn)行檢測(cè)；一抗選用羅氏診斷B-raf V600E(VE1)抗體，陽(yáng)性判讀標(biāo)準(zhǔn)為腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)著色，并設(shè)有陰陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.2RT-PCR 通過病理診斷選取腫瘤細(xì)胞富集的蠟塊進(jìn)行常規(guī)切片，4 μm厚切片，合計(jì)10張。采用Biotron DNA提取試劑盒進(jìn)行提取DNA，并應(yīng)用ND-8000超微量分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA進(jìn)行濃度及質(zhì)量測(cè)定，其符合標(biāo)準(zhǔn)為1.7

2 結(jié)果

2.1RT-PCR與免疫組化法染色檢測(cè)PTC經(jīng)RT-PCR檢測(cè)內(nèi)參基因擴(kuò)增的同時(shí)，B-raf目標(biāo)基因與陽(yáng)性對(duì)照也擴(kuò)增，而陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增(圖1)。免疫組化Ventana BenchMark法染色結(jié)果顯示，PTC腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)經(jīng)DAB染色呈棕色，細(xì)胞核經(jīng)蘇木精染色呈藍(lán)色(圖2)。

圖1 RT-PCR檢測(cè)B-raf基因V600E突變

黑色為檢測(cè)標(biāo)本目標(biāo)基因，藍(lán)色為內(nèi)參，紅色為陽(yáng)性對(duì)照，綠色為陰性對(duì)照

圖2免疫組化檢測(cè)B-raf基因V600E突變：B-raf基因V600E突變?cè)赑TC腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)呈棕色，細(xì)胞核藍(lán)染，Ventana BenchMark法

2.2RT-PCR與免疫組化染色分析兩種方法檢測(cè)的陽(yáng)性率均為83.82%(114/136)，其中兩種方法檢測(cè)的陽(yáng)性符合率為99.1%(113/114)，陰性符合率為95.5%(21/22)。另外，免疫組化染色陽(yáng)性而RT-PCR陰性1例；免疫組化染色陰性而RT-PCR陽(yáng)性1例(表1)。

表1 免疫組化和RT-PCR檢測(cè)BRAF V600E突變分析

3 討論

PTC中B-raf基因V600E突變的檢測(cè)對(duì)乳頭狀不典型增生的鑒別診斷有較好的指導(dǎo)作用[3]，也與臨床手術(shù)切除范圍、治療及預(yù)后密切相關(guān)[4-5]。因此，對(duì)其檢測(cè)非常必要。RT-PCR法是目前B-raf基因V600E位點(diǎn)突變應(yīng)用較廣泛的檢測(cè)技術(shù)，其檢測(cè)靈敏性和特異性均高于免疫組化法。本實(shí)驗(yàn)對(duì)RT-PCR和免疫組化染色法結(jié)果進(jìn)行分析，兩者結(jié)果的陰、陽(yáng)性符合率均較高，但仍有2例不符合。作者對(duì)2例不符合病例進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)其中1例免疫組化染色陰性標(biāo)本，當(dāng)時(shí)在做免疫組化染色時(shí)未設(shè)陽(yáng)性對(duì)照，其陰性的真實(shí)性值得推敲。對(duì)該標(biāo)本進(jìn)行第2次免疫組化染色，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果顯示B-raf基因V600E突變，與RT-PCR陽(yáng)性結(jié)果一致。另1例免疫組化染色小灶陽(yáng)性的標(biāo)本因?yàn)樯氐挠绊?，?dǎo)致病理醫(yī)師誤判為小灶陽(yáng)性，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)確定其陰性。結(jié)果修正判讀后，免疫組化染色結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)100%，與中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院應(yīng)建明教授團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果高度一致[6]。

綜上所述，RT-PCR法檢測(cè)PTC的B-raf基因V600E突變結(jié)果穩(wěn)定，是臨床檢測(cè)的首選方法；免疫組化染色由于特異性和靈敏性均較低，可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生偏差；但只要在檢測(cè)過程中避免影響免疫組化染色非特異性的因素，并選取正確的陽(yáng)性對(duì)照，其對(duì)于未能開展分子檢測(cè)的病理科或?qū)嶒?yàn)室也是較好的初篩工具，對(duì)PTC的預(yù)后和治療均有一定的指導(dǎo)作用。

[1] 李小強(qiáng)，張惠箴，蔣智銘，等. 甲狀腺乳頭狀癌中BRAF基因的表達(dá)及意義[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2012,28(9):991-995.

[2] 黃 偉，吳高松. 甲狀腺癌相關(guān)BRAF基因研究的新進(jìn)展[J]. 中國(guó)普通外科雜志, 2010,19(5):559-563.

[3] 張 翼，李 惠，陳 劼，等. BRAF基因突變檢測(cè)在甲狀腺乳頭狀病變中的臨床意義[J]. 中外醫(yī)療, 2014,33(9):15-17.

[4] Eloy C, Santos J, Soares P,etal. The preeminence of growth pattern and invasiveness and the limited influence of BRAF and RAS mutations in the occurrence of papillary thyroid carcinoma lymph node metastases[J]. Virchows Archiv, 2011,459(3):265-276.

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時(shí)間：2017-7-18 11:52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1152.029.html

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陽(yáng) 宇，男，碩士，醫(yī)師。Tel:(020)39318331，E-mail：729195014@qq.com 鄭廣娟，女，教授，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail：zhengguangjuan@163.com

R 394-33

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1001-7399(2017)07-0815-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.029

接受日期：2017-05-26