方立武，賀海珍，朱從倫，沈 慧，彭魯璐

結(jié)直腸癌中CXCL9的表達及其臨床意義

方立武，賀海珍，朱從倫，沈 慧，彭魯璐

目的檢測趨化因子CXCL9在結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)組織及癌旁組織中的表達，探討其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化EnVision法檢測95例CRC及55例癌旁組織中CXCL9的表達。結(jié)果CRC中CXCL9高表達51例(53.7%，51/95)，癌旁組織中高表達11例(20.0%，11/55)。CXCL9在CRC中高表達發(fā)生率顯著高于癌旁組織(P<0.05)。CXCL9高表達和腫瘤分化程度高、未達漿膜浸潤、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移及TNM低分期具有相關(guān)性(P<0.05)。CXCL9高表達CRC患者的5年無瘤生存期及總生存期明顯高于低表達組(P<0.05)。結(jié)論CXCL9可能參與CRC的發(fā)生、發(fā)展，其高表達提示CRC患者預(yù)后較好。

結(jié)直腸腫瘤；趨化因子；CXCL9；預(yù)后；免疫組織化學(xué)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是全球常見的惡性腫瘤，其侵襲及遠處轉(zhuǎn)移是CRC患者預(yù)后不良的主要原因[1]。CXCL9與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系密切，其在CRC中的作用近年來逐漸受到關(guān)注[2]。本文應(yīng)用免疫組化EnVision法檢測CXCL9在CRC組織中的表達，分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為CRC的治療尋找潛在靶點。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集2009年1月～2011年12月浙江省象山第一人民醫(yī)院病理科95例CRC組織石蠟標(biāo)本及55例對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未行放、化療或免疫治療?；颊吣挲g為26～83歲，中位年齡為58歲，女性42例，男性53例；腫瘤直徑≤5 cm者45例，>5 cm者50例；腫瘤位于結(jié)腸43例，位于直腸52例；組織病理學(xué)分級：高分化者34例，中分化者38例，低分化者23例；血管有浸潤者30例，無浸潤者65例；浸潤達漿膜者55例，未達漿膜者40例；淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移者49例，無轉(zhuǎn)移者46例；按美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)第7版CRC TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進行分期：Ⅰ+Ⅱ期59例，Ⅲ+Ⅳ期36例；癌胚抗原濃度≤5 μg/L者56例，>5 μg/L者16例，不明確者23例；隨訪從手術(shù)之日開始，末次隨訪日期為2015年12月25日。本組患者隨訪時間均超過5年。

1.2方法所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，免疫組化采用EnVision兩步法染色，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。所用抗體購自上海長島公司。

1.3判斷標(biāo)準(zhǔn)CXCL9以胞膜或胞質(zhì)呈棕黃色為陽性。由兩名資深病理醫(yī)師根據(jù)染色強度和染色細(xì)胞百分比分別進行評定和分析，結(jié)果判斷均采用統(tǒng)一評分標(biāo)準(zhǔn)和雙盲法。按陽性細(xì)胞數(shù)分為：無陽性細(xì)胞為0分、≤10%為1分、11%～50%為2分、51%～80%為3分、>80%為4分。按染色強度分為：無陽性著色為0分、弱陽性為1分、中等強度為2分、強陽性為3分。將陽性細(xì)胞數(shù)乘以平均染色強度得出評分范圍：0～12分。評分≤4分為無或低表達，>4分為高表達。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，CXCL9表達與CRC臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗，對生存數(shù)據(jù)應(yīng)用Kaplan-Meier分析并繪制生存曲線，運用Log-rank檢驗差異性。

2 結(jié)果

2.1CXCL9在CRC及癌旁組織中的表達CXCL9定位于腫瘤細(xì)胞的胞膜及胞質(zhì)(圖1、2)。95例癌組織中CXCL9高表達51例(53.7%，51/95)，癌旁組織中高表達11例(20.0%，11/55)。CXCL9在CRC和癌旁組織中的表達差異，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

①②

圖1CXCL9在腫瘤細(xì)胞中低表達，EnVision法圖2CXCL9在腫瘤細(xì)胞中高表達，EnVision法

2.2CXCL9表達與CRC臨床病理特征的關(guān)系CXCL9高表達和腫瘤較高的分化程度、未達漿膜浸潤、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移及較低的TNM分期具有相關(guān)性(P<0.05)；與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、血管浸潤及癌胚抗原濃度均無相關(guān)性(P>0.05，表1)。

表1 CXCL9表達與CRC臨床病理特征的關(guān)系

2.3CXCL9表達與CRC患者預(yù)后的關(guān)系CRC腫瘤細(xì)胞CXCL9高表達組患者的5年無瘤生存率為70.6%(36/51)，中位生存時間65個月，低表達者43.2%(19/44)，中位生存時間58個月，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.043，P<0.05)。此外，CXCL9高表達組5年總生存率為74.5%(38/51)，中位生存時間69個月，低表達者5年總生存率為52.3%(23/44)，中位生存時間60個月，CXCL9高表達的患者生存期明顯高于低表達組(χ2=6.825，P<0.05，圖3、4)。

3 討論

趨化因子是一類包含4個保守半胱氨酸殘基，具有化學(xué)趨化功能的多肽。根據(jù)其第1、2個半胱氨酸所含其它氨基酸的個數(shù)，可分為CXC、CC、C及C3XC 4個亞族。目前，有許多關(guān)于趨化因子及其受體在腫瘤形成及進展中作用分析。CXC趨化因子及其受體可以從幾方面調(diào)節(jié)腫瘤的生物學(xué)行為，如調(diào)節(jié)血管生成，通過吸引白細(xì)胞激活腫瘤特異性免疫反應(yīng)，刺激腫瘤細(xì)胞的增生及轉(zhuǎn)移[3]。趨化因子CXCL9是趨化因子CXC亞族的一員，人CXCL9基因位于染色體4q21上，緊鄰編碼CXCL10的基因。在體內(nèi)主要由干擾素γ(INF-γ)刺激巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞產(chǎn)生[4]。研究表明CXCL9可以在乳腺癌[5]、腎細(xì)胞癌[6]、CRC[7]及非小細(xì)胞肺癌[8]中表達。CXCR3是CXCL9的受體，其為7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，其胞內(nèi)區(qū)與G蛋白偶聯(lián)。同時，CXCR3也是趨化因子CXCL10及CXCL11的受體[9]。

圖3 CXCL9表達與CRC患者5年無瘤生存期的關(guān)系

圖4 CXCL9表達與CRC患者5年總生存率的關(guān)系

本實驗中CXCL9高表達率為53.7%，顯著高于癌旁正常組織，表明CXCL9在CRC的發(fā)生過程中發(fā)揮作用。CXCL9高表達和腫瘤較高的分化程度、未達漿膜浸潤、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移及較低的TNM分期具有顯著相關(guān)性，提示CXCL9高表達不利于腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。CXCL9高表達患者的5年無瘤生存期及總生存期均顯著高于低表達患者。有研究報道CRC中CXCL9及CXCL10高表達提示患者預(yù)后較好，無瘤生存期較長，同時記憶性CD8+及CD4+T細(xì)胞數(shù)量也較多；與本組結(jié)果基本一致。CXCL9高表達提示患者預(yù)后較好，評估CXCL9表達有助于選擇CRC患者免于術(shù)后的輔助治療，該患者腫瘤進展的風(fēng)險相對較低。CXCL9低表達提示患者預(yù)后較差，患者術(shù)后需密切監(jiān)測。我們認(rèn)為以下3種原因可以解釋為何CXCL9高表達提示患者預(yù)后良好。CXCL9在惡性腫瘤中高表達，它的抗腫瘤活性主要通過促進免疫反應(yīng)介導(dǎo)的，例如增強細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)，促進CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤到腫瘤細(xì)胞區(qū)域殺傷腫瘤細(xì)胞[10]。CXCL9及CXCL10不但可以趨化吸引T淋巴細(xì)胞浸潤到腫瘤細(xì)胞的區(qū)域，而且可以擴大T淋巴細(xì)胞引起的效應(yīng)[11]。有研究表明CRC中CXCL9及CXCL10高表達的病例中CD8+記憶性T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的數(shù)量也較多，提示患者預(yù)后較好，且和較長的無瘤生存期相關(guān)[12]。其次，CXCL9結(jié)合到其受體CXCR3具有抗血管生成的作用；其通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞相作用，并且招募T或NK細(xì)胞，它們可以破壞腫瘤的血管形成[13]。血管形成在腫瘤形成、進展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，研究表明CXCL9可以抑制腫瘤血管生成，從而引起瘤體消退。聯(lián)合pORF-CXCL9及順鉑可以更好的抑制腫瘤血管生成，誘導(dǎo)凋亡及增強細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性，這些均具有抗腫瘤的活性[14]。例如CXCL9過表達通過降低腫瘤相關(guān)血管形成從而抑制肺非小細(xì)胞肺癌生長及轉(zhuǎn)移[15]。最后，Liu等[16]報道CXCL9或CXCR3拮抗劑可以抑制惡性黑色素瘤及乳腺癌的轉(zhuǎn)移。上述結(jié)果均表明CXCL9有望成為CRC的預(yù)后標(biāo)記及治療靶點。

綜上所述，本實驗結(jié)果提示CXCL9可能參與CRC的發(fā)生、發(fā)展，其高表達提示患者預(yù)后良好。檢測CXCL9的表達可以更好的指導(dǎo)臨床醫(yī)師進行實際工作，并為CXCL9成為CRC治療策略的潛在靶點提供依據(jù)。

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