汪曉琳

(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

黑胡椒中胡椒堿的提取及抗氧化性研究

汪曉琳

(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

對(duì)胡椒堿的提取工藝及抗氧化性進(jìn)行了研究。以黑胡椒為原料，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了乙醇濃度、料液比、超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)胡椒堿提取工藝的影響，并對(duì)胡椒堿抗氧化性能進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明：胡椒堿最佳提取工藝為乙醇濃度80%、料液比1∶20、超聲功率700 W、超聲時(shí)間80 min，該工藝條件下胡椒堿的提取率達(dá)到5.43%；提取的胡椒堿具有很好的抗氧化活性，且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，當(dāng)胡椒堿的濃度為6 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子的清除率分別達(dá)到72.6%和54.7%。

黑胡椒；胡椒堿；正交試驗(yàn)；超聲提取

胡椒(PipernigrumL.)，別名昧履支、坡洼熱，是胡椒科、胡椒屬攀援藤本植物，其果實(shí)曬干后呈黑褐色，稱為黑胡椒。黑胡椒是一種重要的熱帶香辛作物，也是我國(guó)廣大人民非常喜歡的調(diào)味品之一[1]。醫(yī)學(xué)研究表明胡椒具有溫中、下氣、消痰、解毒之功效，可用于消化不良、咳嗽、支氣管炎、腹痛泄瀉等癥狀[2,3]。在食品工業(yè)中，胡椒也廣泛用于腌制品的防腐性香料[4]。

胡椒堿(piperine) 是黑胡椒中的主要生理活性成分之一，屬于桂皮酰胺類生物堿，具有抗驚厥、抗癌、抗氧化、抗炎、促進(jìn)藥物吸收等多種藥理學(xué)活性[5]。目前胡椒堿的提取方法主要有酸水提取法、有機(jī)溶劑提取法、微波提取法、超聲波提取法等[6,7]。超聲波提取是利用超聲波產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，增大細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的通透性以提取其生物活性成分。該法不僅可以縮短提取時(shí)間，而且降低溶劑用量和能耗，提高提取效率[8]。由于超聲波提取操作簡(jiǎn)單，運(yùn)行成本低，經(jīng)濟(jì)效應(yīng)顯著，目前已經(jīng)廣泛用于中藥及天然藥物中各種活性成分的提取[9,10]。

隨著人民生活水平和健康意識(shí)的提高，食品安全已經(jīng)成為全社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)。食品加工中廣泛使用的抗氧化劑對(duì)健康的潛在影響引起醫(yī)學(xué)專家和消費(fèi)者的擔(dān)憂，因此開發(fā)天然抗氧化劑勢(shì)在必行。本文對(duì)超聲波提取胡椒堿的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過體外對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基的清除來評(píng)價(jià)胡椒堿的抗氧化性能，為新型天然抗氧化劑的研發(fā)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

黑胡椒 市售；胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品 四川省維克奇生物科技有限公司；DPPH自由基 Sigma公司；鄰苯三酚 上海展云化工有限公司；無(wú)水乙醇 蘇州歐特化工有限公司。

1.1.2 主要儀器

LC-2900 型高效液相色譜儀 上海天普分析儀器有限公司；PC1200N 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 冠森生物科技(上海)有限公司；XB220A型電子天平 瑞士PRECISA公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海政泓實(shí)業(yè)有限公司；TV1901型分光光度計(jì) 上海奧析科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胡椒堿的提取

將黑胡椒放入50 ℃的恒溫干燥箱干燥3 h，用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，得黑胡椒粉末。稱取10.0 g黑胡椒粉末，以一定的料液比加入不同濃度乙醇溶液，室溫下浸漬2 h，然后在一定功率下的超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中提取一定時(shí)間，過濾，置于60 ℃的水浴鍋中減壓濃縮，真空干燥后得胡椒堿粉末。

1.2.2 胡椒堿的檢測(cè)

1.2.2.1 高效液相色譜法的色譜條件

C18色譜柱(4.6 mm×200 mm×5 μm)，流動(dòng)相甲醇-水(70∶30)，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)343 nm，柱溫為常溫，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，置于50 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0,2.0,4.0,6.0,8.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻。按色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=29485.54 X-497.27，r=0.9983。

1.2.2.3 胡椒堿的測(cè)定

稱取1.2.1中的胡椒堿粉末5 mg，置于10 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度；0.22 μm的濾膜過濾，進(jìn)樣檢測(cè)，外標(biāo)法計(jì)算胡椒堿的含量。胡椒堿的提取率(%)=胡椒堿重量/反應(yīng)黑胡椒粉末重量×100%。

1.2.3 胡椒堿對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

采用分光光度法[11]，將胡椒堿用無(wú)水乙醇稀釋成濃度為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mg/mL的溶液。分別吸取各待測(cè)樣品溶液2 mL，加入2 mL 2×104mol/L DPPH自由基溶液中，混勻后水浴保溫30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度Ai。按前述方法同時(shí)測(cè)定2 mL無(wú)水乙醇與2 mL DPPH自由基混合溶液的吸光度A0，2 mL無(wú)水乙醇與2 mL各待測(cè)樣品混合溶液的吸光度Aj。按照下式計(jì)算胡椒堿對(duì)DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基清除率(%)=[ A0-(Ai-Aj)]/A0×100%。

1.2.4 胡椒堿對(duì)超氧陰離子清除能力的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法[12]，向試管中依次加入pH 8.2的Tris-HCl緩沖液6 mL、胡椒堿溶液0.5 mL，25 ℃水浴20 min，再加入同溫度下預(yù)熱過的7 mmol/L的鄰苯三酚鹽酸溶液1 mL，溶液震蕩混勻，靜置4 min，加入0.5 mL的濃鹽酸溶液終止反應(yīng)，以10 mmol/L的鹽酸溶液作為參比，測(cè)定325 nm處的吸光度值A(chǔ)1。同時(shí)，用鹽酸溶液代替樣液，測(cè)定325 nm處空白溶液的吸光度A0，按下式計(jì)算樣品對(duì)超氧陰離子的清除率。

超氧陰離子清除率(%)=(A0- A1)/A0×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)胡椒堿提取率的影響

按1.2.1所述的方法，稱取黑胡椒各10.0 g，以料液比(g/mL)1∶10分別加入60%，70%，80%，90%，100%的乙醇100 mL，在500 W超聲功率下提取40 min，考察乙醇濃度對(duì)胡椒堿提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)胡椒堿提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of piperine

由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，胡椒堿提取率不斷提高，當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，胡椒堿提取率達(dá)到最大(3.92%)，隨后開始下降。這是由于胡椒堿和乙醇之間存在“相似相溶”，提取率增加；當(dāng)乙醇濃度過高時(shí)，二者之間功能基團(tuán)相互排斥，胡椒堿提取率隨之下降。因此，選擇80%乙醇較佳。

2.1.2 料液比對(duì)胡椒堿提取率的影響

按1.2.1所述的方法，稱取黑胡椒各10.0 g，分別以料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 (g/mL)加入80%乙醇，在500 W超聲功率下提取40 min，考察料液比對(duì)胡椒堿提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對(duì)胡椒堿提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of piperine

由圖2可知，胡椒堿提取率隨著料液比的增加而增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20后，胡椒堿提取率增加緩慢。這是因?yàn)榱弦罕鹊蜁r(shí)，胡椒堿在溶劑中容易達(dá)到飽和，抑制胡椒堿的釋放；料液比較高時(shí)有利于胡椒堿的釋放；當(dāng)料液比過高時(shí)容易造成溶劑的浪費(fèi)。因此，選擇料液比1∶20較為合適。

2.1.3 超聲功率對(duì)胡椒堿提取率的影響

按1.2.1所述的方法，稱取黑胡椒各10.0 g，以料液比1∶20 (g/mL)加入80%乙醇，在300，400，500，600，700，800 W超聲功率下提取40 min，考察超聲功率對(duì)胡椒堿提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲功率對(duì)胡椒堿提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of piperine

由圖3可知，隨著超聲功率的增加，胡椒堿提取率呈先快速增加而后緩慢下降的趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率為600 W時(shí)，胡椒堿的提取率最高，達(dá)到4.52%。這是因?yàn)槌暪β蔬^大時(shí)，升溫過快，容易造成胡椒堿的降解，使得提取率下降。因此，選擇超聲功率600 W為宜。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)胡椒堿提取率的影響

按1.2.1所述的方法，稱取黑胡椒各10.0 g，以料液比1∶20 (g/mL)加入80%乙醇，在600 W的功率下分別超聲40，60，80，100，120 min，考察超聲時(shí)間對(duì)胡椒堿提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)胡椒堿提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of piperine

由圖4可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，胡椒堿提取率呈現(xiàn)先升后降的 “倒V型”趨勢(shì)；當(dāng)超聲80 min時(shí)，胡椒堿提取率達(dá)到最大，為4.89%。延長(zhǎng)超聲時(shí)間可以提高胡椒堿提取含量，但是時(shí)間過長(zhǎng)可能出現(xiàn)胡椒堿降解情況，導(dǎo)致胡椒堿提取率下降，同時(shí)雜質(zhì)增加。因此，選擇時(shí)間為80 min較佳。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)2.1中單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)乙醇濃度、料液比、超聲功率和超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以期獲得最佳的胡椒堿提取工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見表1。

表1 胡椒堿提取正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment of piperine extraction

正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見表2和表3。

表2 胡椒堿提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiment of piperine extraction

續(xù) 表

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

根據(jù)表2極差R值大小可知影響胡椒堿提取率的各因素主次順序?yàn)锳>C>D>B，即乙醇濃度>超聲功率>超聲時(shí)間>料液比。根據(jù)K值可以得出胡椒堿的最佳提取條件為A2B2C3D2，即乙醇濃度80%、料液比1∶20、超聲功率700 W、超聲時(shí)間80 min。在此條件下，進(jìn)行3批工藝驗(yàn)證，胡椒堿的提取率達(dá)到5.43%。

由表3可知，因素A和因素D的F值都大于F臨界值，可知因素A(乙醇濃度)和因素D(超聲功率)對(duì)胡椒堿的提取有顯著的影響，是胡椒堿提取工藝中的關(guān)鍵參數(shù)。

2.3 胡椒堿抗氧化性能測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子的清除率作為評(píng)價(jià)胡椒堿抗氧化性能的指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 胡椒堿對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子的清除作用Fig.5 Scavenging effects of piperine on DPPH free radical and superoxide anion

由圖5可知，胡椒堿對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子均有較好的清除作用，且胡椒堿對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子的清除率隨著濃度的增加而逐漸上升，存在明顯的量效關(guān)系。當(dāng)胡椒堿的濃度為6 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子的清除率分別達(dá)到72.6%和54.7%，由此可見，本實(shí)驗(yàn)提取的胡椒堿具有良好的抗氧化性能。

3 結(jié)論

胡椒是古老而著名的調(diào)味香料，廣泛用于烹飪調(diào)料，在醫(yī)藥和食品工業(yè)也具有很多用途。胡椒堿是黑胡椒的主要活性物質(zhì)之一，近年來引起學(xué)者和企業(yè)界的廣泛關(guān)注，對(duì)胡椒堿的生物活性和藥理作用的研究非?；钴S[13,14]。本研究以黑胡椒為原料，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)超聲提取胡椒堿的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)胡椒堿抗氧化性能進(jìn)行了初步研究。得到胡椒堿的最佳提取條件為：乙醇濃度80%、料液比1∶20、超聲功率700 W、超聲時(shí)間80 min，該工藝條件下胡椒堿的提取率達(dá)到5.43%；提取的胡椒堿對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子具有很好的抑制率，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，且當(dāng)胡椒堿的濃度為6 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子的清除率分別達(dá)到72.6%和54.7%，可見胡椒堿具有很好的抗氧化活性。這為胡椒堿作為天然抗氧化劑的開發(fā)提供了很有意義的基礎(chǔ)。

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Study on the Extraction and Antioxidant Activity of Piperine fromPipernigrum

WANG Xiao-lin

(Jiangsu Food & Pharmaceutical Science College，Huai'an 223003, China)

In this paper, the extraction technology and antioxidant activity of piperine are studied. WithPipernigrumas raw material, the effects of ethanol concentration, solid-liquid ratio, ultrasonic power and ultrasonic time on the extraction technology of piperine are studied by orthogonal test design, and the antioxidant activity of piperine is also investigated. The results show that the optimum extraction process of piperine is ethanol concentration of 80%, solid-liquid ratio of 1∶20, ultrasonic power of 700 W, ultrasonic time of 80 min, the extraction rate of piperine reaches 5.43% under such conditions. The extracted piperine has good antioxidant activity, and it shows an obvious dose-effect relationship. When the concentration of piperine is 6 mg/mL, the scavenging rates of DPPH radical and superoxide anion are 72.6% and 54.7% respectively.

Pipernigrum；piperine；orthogonal test；ultrasonic extraction

2017-03-10

汪曉琳(1979-)，女，講師，碩士，研究方向：食品加工。

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.011

1000-9973(2017)09-0051-04