熊笙屹++厙潤(rùn)祥++張璐++孟令晨++于月華++倪志勇

摘 要：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法作為植物基因工程使用最廣泛的轉(zhuǎn)化方法之一，分為根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒和根瘤農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒2種類型。發(fā)根農(nóng)桿菌（A gmbacterium rhiz-ogenes）的Ri質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生毛狀根。本文闡述了發(fā)根農(nóng)桿菌的特性及 Ri質(zhì)粒的分類、結(jié)構(gòu)特征和轉(zhuǎn)化特點(diǎn)，介紹了發(fā)根農(nóng)桿菌在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用，分析了影響發(fā)根農(nóng)桿菌成功轉(zhuǎn)化的因素，綜述了發(fā)根農(nóng)桿菌在理論研究、植物基因工程、植物品種改良、植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)和植物栽培生根等方面的應(yīng)用，并指出未來(lái)領(lǐng)域研究的著重點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：發(fā)根農(nóng)桿菌；Ri質(zhì)粒；研究進(jìn)展；應(yīng)用

中圖分類號(hào)：Q943 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170833061

目前，轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化的方法主要有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法、核顯微注射法、基因槍法等，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系是在植物基因工程中相對(duì)完整、成熟的方法之一。在轉(zhuǎn)基因植物中有80%以上是由農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的，但是其中大部分是由根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化獲得的[1]。1907年，Smith和Townsend 發(fā)現(xiàn)發(fā)根農(nóng)桿菌（A grobacterium rhizogenes）能誘導(dǎo)植物形成毛狀根（hairy root），1934年Hildebrand就報(bào)道了發(fā)根農(nóng)桿菌（A grobacterium rhizogenes）感染蘋(píng)果樹(shù)能誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根（hairy root）[2]。1977年，Montoya等首次應(yīng)用Ti質(zhì)粒作為載體將T-DNA上的農(nóng)桿堿基因轉(zhuǎn)入煙草細(xì)胞[3]，標(biāo)志著遺傳轉(zhuǎn)化新時(shí)代的到來(lái)。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)逐步走向成熟，并成為植物基因工程改良新品種的基礎(chǔ)技術(shù)。1982年，Chilton 報(bào)道發(fā)根農(nóng)桿菌（A grobacterium rhizogenes）能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生發(fā)狀根（Hairy root），這種發(fā)狀根又被稱為毛狀根，是由發(fā)根農(nóng)桿菌所含有的 Ri質(zhì)粒（Root inducing plasmid）引起的，Ri質(zhì)粒不僅是遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)良載體 ，而且可直接感染植物細(xì)胞[4]。與根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒相比 ，根瘤農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化具有以下優(yōu)點(diǎn)；用Ri質(zhì)粒作為基因載體時(shí)，不需要通過(guò)“解除武裝”（disarmed）就可以很容易地從轉(zhuǎn)化來(lái)的細(xì)胞上獲得再生植株，即用野生型發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物可直接再生出完整的植株；由發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的植物，其產(chǎn)生的毛狀根均來(lái)源于同一個(gè)植物細(xì)胞[5]。毛狀根的每一個(gè)細(xì)胞都是轉(zhuǎn)基因的，更加有利于遺傳操作；根瘤農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒不含onc基因，對(duì)再生植物的染色體影響極小；由發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的毛狀根分化為正常植株的分化率高，倍性穩(wěn)定，遺傳穩(wěn)定，并且容易建成一系列能夠在不同植物細(xì)胞核染色體上插入一個(gè)T-DNA拷貝的株系[6]。盡管發(fā)根培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展歷史雖然較短，但Ri質(zhì)粒作為植物基因工程載體已顯現(xiàn)出其可行性與方便性。隨著科學(xué)研究的逐步深入，它將會(huì)成為比Ti質(zhì)粒更理想的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。更多的次生代謝物將會(huì)通過(guò)發(fā)根培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)，并被用于難以插活植物的生根和生產(chǎn)外源基因產(chǎn)品，特別是在獲得轉(zhuǎn)基因植物、培育新品種等方面存在廣闊前景。

1 發(fā)根農(nóng)桿菌及Ri質(zhì)粒特征

1.1 發(fā)根農(nóng)桿菌

發(fā)根農(nóng)桿菌（A grobacterium rhizogenes）屬于根瘤菌科（Rhizobitaceae）農(nóng)桿菌屬（A grobacterium）的革蘭氏陰性菌。發(fā)根農(nóng)桿菌是一類宿主范圍廣泛土壤桿菌，在侵染植物后，能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量高度分支的不定根，通常稱為發(fā)根。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物所產(chǎn)生的發(fā)根具有生長(zhǎng)速度快、分化程度高、生理生化和遺傳性穩(wěn)定、易于進(jìn)行操作控制等特點(diǎn)[7]。發(fā)根農(nóng)桿菌的致根特征結(jié)構(gòu)包括染色體毒性基因（Chromosomal Virulence，ChV） 和Ri質(zhì)粒2個(gè)部分。ChV是發(fā)根農(nóng)桿菌的染色體基因，它的活化表達(dá)與發(fā)根農(nóng)桿菌在植物細(xì)胞壁的附著有關(guān)。Ri，質(zhì)粒是發(fā)根農(nóng)桿菌染色體外的一個(gè)具有侵入性的質(zhì)粒。在自然狀態(tài)下，發(fā)根農(nóng)桿菌通過(guò)傷口入侵植物，Ri質(zhì)粒上的T-DNA能插入植物基因組，其上所攜帶的基因在宿主細(xì)胞中整合表達(dá)，使植物產(chǎn)生毛狀根。發(fā)根農(nóng)桿菌的宿主范圍隨菌株的不同而發(fā)生變化[8]。發(fā)根農(nóng)桿菌能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物以及個(gè)別裸子。到目前為止，已有160 多種植物成功誘導(dǎo)出了毛狀根，大多數(shù)集中在茄科、菊科、十字花科、旋花科、傘形科、豆科、石竹科、蓼科等，主要是草本植物，而木本植物較少有成功的報(bào)道 [9]。

1.2 發(fā)根農(nóng)桿菌 Ri質(zhì)粒的分類及基本特征

1.2.1 Ri質(zhì)粒的分類

根據(jù)其合成冠癭堿的不同，可將Ri質(zhì)粒分為4種類型：甘露堿型（Mannopine Type），合成甘露堿及其酸、農(nóng)桿堿酸與農(nóng)桿堿素A；黃瓜堿型（Cucumopin Type），合成黃瓜堿；農(nóng)桿堿型（Agropine Type），合成農(nóng)桿堿及其酸、甘露堿及其酸、農(nóng)桿堿素A；米奇矛型（Mikimopine Type）。發(fā)根農(nóng)桿菌的致根特性與Ri質(zhì)粒類型有關(guān)， Petit等發(fā)現(xiàn)含農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌較甘露堿型、黃瓜堿型和米奇矛型有更為廣泛的宿主范圍。即使對(duì)同一種農(nóng)桿菌來(lái)說(shuō)，致根特性又與被接種的寄主植物及接種的部位有關(guān)[10]。

1.2.2 結(jié)構(gòu)和類型

發(fā)根農(nóng)桿菌 （含Ri質(zhì)粒）侵染植物后會(huì)產(chǎn)生許多生長(zhǎng)迅速、分枝呈毛狀的不定根，稱為毛狀根。圖1顯示，Ri質(zhì)粒為根誘導(dǎo)質(zhì)粒（Root Inducing Plas mid）；Ri質(zhì)粒的大小為200～800kb，它含有負(fù)責(zé)發(fā)根自主性生長(zhǎng)和冠癭堿合成的基因，在結(jié)構(gòu)上有致毒區(qū)（Vir區(qū)），轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物細(xì)胞核的T-DNA區(qū)及其內(nèi)部的冠癭堿合成功能區(qū)等[11]。根據(jù)其合成冠癭堿的不同，可將Ri質(zhì)粒分為 4 種類型：甘露堿型（Mannopine Type），合成甘露堿及其酸、 農(nóng)桿堿酸與農(nóng)桿堿素A；黃瓜堿型（Cucumopin Type），合成黃瓜堿；農(nóng)桿堿型（Agrop-ine Type），合成農(nóng)桿堿及其酸、甘露堿及其酸、農(nóng)桿堿素A；米奇矛型（Mikimopine Type），Petit等發(fā)現(xiàn)含農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌較甘露堿型、瓜堿型和米奇矛型有更為廣泛的宿主范圍[12]。endprint

圖1 農(nóng)桿菌 Ri 質(zhì)粒模式

1.2.3 Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化特點(diǎn)

Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在以下5個(gè)方面：Ri質(zhì)?？烧T導(dǎo)植物外植體生成毛狀根并由其再生成植株[13]；生成的毛狀根屬于單克隆，可有效地避免嵌合體的形成；作為中間載體[14]；Ri質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒可共同構(gòu)建雙元載體，使Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒的應(yīng)用范圍更加廣闊；毛狀根在離體培養(yǎng)條件下具有合成原植株次生代謝產(chǎn)物的能力[15]。因此，Ri質(zhì)粒作為植物基因工程的有效載體，可以生產(chǎn)出更多的次生代謝產(chǎn)物。近幾年，發(fā)根農(nóng)桿菌的應(yīng)用領(lǐng)域已經(jīng)越來(lái)越寬泛，備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。

2 影響毛狀根誘導(dǎo)的因素

2.1 菌株

目前采用的發(fā)根農(nóng)桿菌主要有天然農(nóng)桿堿型的A4、ATCCl5834、16834、LBA9402及1601、R1000、R1200等人工構(gòu)造質(zhì)粒；還有黃瓜堿型的2635、2657、2659等；以及甘露堿型的5196、TRl01、TR7等，不同菌株對(duì)不同植物或不同植株的侵染能力不同[16]。菌液濃度對(duì)毛狀根的誘導(dǎo)也存在一定的影響。一般菌種濃度過(guò)大，細(xì)菌生長(zhǎng)迅速，在一定程度上抑制細(xì)胞代謝過(guò)程，且不易除菌；濃度太稀，能附著在細(xì)胞的細(xì)菌太少，不足以形成足夠的毛狀根。

2.2 外植體

目前轉(zhuǎn)化成功的植物主要是草本植物，尤以雙子葉植物為多，也有為數(shù)不多的單子葉植物（如栝樓、旱墨蓮、露水草）和少數(shù)木本植物（如銀杏）等誘導(dǎo)成功。已成功誘導(dǎo)出毛狀根的植物外植體有葉片，莖、子葉、愈傷組織、下胚軸等多種，但不同的外植體發(fā)狀根的誘導(dǎo)率不同。受傷后酚類化合物的合成是影響植物對(duì)Ri質(zhì)粒的敏感性的主要因素。外植體的選取十分關(guān)鍵，一般采用的都是較幼嫩的組織，因?yàn)檫@些細(xì)胞處于旺盛的分裂期，容易接受外源DNA。Ackrmann等首次報(bào)道了應(yīng)用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化高等植物之后，相繼有成功的報(bào)道，而且轉(zhuǎn)化植物的種類也不再僅僅局限于雙子葉植物，已擴(kuò)展至玉米、楊樹(shù)、蘋(píng)果等植物，在藥用植物方面也有報(bào)道 [17]。

2.3 化學(xué)因子

植物受傷后產(chǎn)生的酚類物質(zhì)能激活vir基因，促使Ri質(zhì)粒向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移，在轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中加入某種酚類物質(zhì)可以促進(jìn)基因轉(zhuǎn)化。目前廣泛使用的是AS、羥基乙酰丁香酮（OH-AS）和香草酚等酚類物質(zhì)來(lái)誘導(dǎo)農(nóng)桿菌， 并在一些轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中取得了好的效果，在發(fā)狀根的誘導(dǎo)過(guò)程中，添加適當(dāng)濃度的外源激素對(duì)于提高發(fā)狀根的誘導(dǎo)頻率有明顯的促進(jìn)作用。發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的rolC生根基因的啟動(dòng)子活性受蔗糖濃度的調(diào)節(jié)，糖類物質(zhì)可以協(xié)助乙酰丁香酮等物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的vir區(qū)基因表達(dá)，從而提高轉(zhuǎn)化率[18]。

2.4 物理因子

2.4.1 光照強(qiáng)度、溫度、pH值對(duì)毛狀根的誘導(dǎo)有很大的影響

農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，使用較低pH的培養(yǎng)基有利于轉(zhuǎn)化頻率的提高。原因可能是在偏酸的培養(yǎng)條件下，有利于農(nóng)桿菌vir區(qū)基因的表達(dá)，但較低pH條件下，培養(yǎng)基的凝固狀態(tài)較差.不利于試驗(yàn)操作，容易污染[19]。

2.4.2 超聲波、微波和真空滲透處理

趙東利等在轉(zhuǎn)化苦豆子時(shí)發(fā)現(xiàn)，采用真空7.0×10Pa滲透15min，可有效提高發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)苦豆子的轉(zhuǎn)化頻率[20]。真空滲透處理在植物材料表面產(chǎn)生很多微損傷，抽真空后形成的負(fù)壓使農(nóng)桿菌更緊密地吸附于外植體傷口及傷口內(nèi)細(xì)胞間隙，促進(jìn)T-DNA向植物細(xì)胞導(dǎo)入。超聲波處理也可在外植體上產(chǎn)生許多微小傷口，從而提高農(nóng)桿菌與外植體之間的接觸面積，提高轉(zhuǎn)化頻率。短暫微波輻射產(chǎn)生的熱效應(yīng)也有助于農(nóng)桿菌T-DNA向植物細(xì)胞導(dǎo)入。

3 發(fā)根農(nóng)桿菌的應(yīng)用

3.1 用于獲得轉(zhuǎn)基因植物和培育作物新品種

由于發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)生成的毛狀根生長(zhǎng)迅速、條件可控且遺傳穩(wěn)定性高，因而生成的毛狀根是進(jìn)行許多與植物根相關(guān)的理論研究的理想試驗(yàn)系統(tǒng)，將經(jīng)過(guò)篩選的含有目的基因的毛狀根轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽的產(chǎn)生，帶芽組織再經(jīng)生根培養(yǎng)即可誘導(dǎo)生根，成為一株完整的轉(zhuǎn)基因再生植株。Ri質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化更可以將外源功能基因?qū)胫参锔担蛊浍@得抗病、抗蟲(chóng)、抗重金屬的多抗性。目前，煙草、苜蓿、豌豆、咖啡等植物都已經(jīng)可以經(jīng)毛狀根誘導(dǎo)再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株。

此外，由發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物獲得的毛狀根所再生的后代會(huì)表現(xiàn)出頂端優(yōu)勢(shì)喪失、葉片皺縮、節(jié)間縮短、花形改變等現(xiàn)象[21]。這種再生植株的矮化現(xiàn)象在花卉矮化育種中具有特別的意義。

3.2 用于生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物

發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的毛狀根能合成該植物的次生代謝物質(zhì)，同時(shí)毛狀根具有生長(zhǎng)周期、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性強(qiáng)、目的產(chǎn)物含量高等特點(diǎn)。因此， 發(fā)根培養(yǎng)技術(shù)是一種有效和可靠的生產(chǎn)合成植物次生代謝產(chǎn)物的有效途徑，從毛狀根培養(yǎng)物中尋找新的藥用化合物具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前，通過(guò)毛狀根培養(yǎng)可以生產(chǎn)的次生代謝物質(zhì)有生物堿類（如吲哚生物堿、喹啉生物堿、茛菪烷生物堿等）、甙類（如人參皂甙、甜菜甙等）、黃酮類、醌類（如紫草寧等）、多糖類、 蛋白質(zhì)（如天花粉蛋白等）和一些重要的生物酶（如超氧化物歧化酶）[22]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)， 國(guó)內(nèi)外已對(duì)23科50余種藥用植物進(jìn)行了毛狀根誘導(dǎo)的研究，建立了長(zhǎng)期的毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)，獲得了次生代謝產(chǎn)物[23]。

4 結(jié)語(yǔ)

近幾年來(lái)，發(fā)根農(nóng)桿菌及其Ri質(zhì)粒在植物基因工程研究、植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)、改良植物品種特性等方面，都取得了廣泛的應(yīng)用。但是利用發(fā)根農(nóng)桿菌實(shí)際應(yīng)用的研究開(kāi)展的時(shí)間還比較短，理論基礎(chǔ)還不扎實(shí)，許多潛在的問(wèn)題和技術(shù)有待解決和完善。就目前的狀況而言，未來(lái)該研究應(yīng)注重研究以下2個(gè)方面：改善毛狀根誘導(dǎo)的環(huán)境條件使其更加簡(jiǎn)單，降低對(duì)設(shè)備的需求，從而減少成本；次生代謝產(chǎn)物的合成機(jī)制，關(guān)鍵酶的作用機(jī)制以及收調(diào)控的核心因素。隨著對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化原理及次生代謝產(chǎn)物合成途徑的逐步研究，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化外源基因及表達(dá)的效率會(huì)不斷提高，可轉(zhuǎn)化的受體植物范圍不斷擴(kuò)大，次生代謝產(chǎn)物合成的效率和產(chǎn)量不斷提高，將為更多植物體加入新遺傳特性的研究帶來(lái)新的動(dòng)力。同時(shí)，高效細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立與不斷完善，天然藥物生物技術(shù)產(chǎn)品的商品化和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程將大大加快，基于發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物次生代謝工程將在農(nóng)業(yè)、健康食品、功能食品和植物抗性等領(lǐng)域更好地造福人類。endprint

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