聶 紅，楊 姍

(1.貴州省畢節(jié)十中，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學院，貴州 畢節(jié) 551700)

畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)臭豆腐質(zhì)量檢測

聶 紅1，楊 姍2*

(1.貴州省畢節(jié)十中，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學院，貴州 畢節(jié) 551700)

選取貴州畢節(jié)市區(qū)毛霉長約1 cm的臭豆腐，利用平板法從臭豆腐菌落中分離、純化得到優(yōu)良毛霉菌落。利用正交分析，對毛霉產(chǎn)蛋白酶的液體發(fā)酵條件進行研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)溫度51 ℃、培養(yǎng)基pH值7.3、培養(yǎng)時間50h條件下，是毛霉產(chǎn)蛋白酶的活性最高，有利于快速水解蛋白質(zhì)。

分離純化；發(fā)酵；正交試驗；毛霉產(chǎn)蛋白酶

毛霉產(chǎn)蛋白酶是蛋白酶中的一種，蛋白酶是作用于蛋白質(zhì)、催化肽鍵水解的一類酶，是工業(yè)酶種中用得最多的一種酶，約占酶總量的60%，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日用化工、制革等諸多行業(yè)，因此一直是國內(nèi)外學者研究的重要課題。蛋白酶的種類很多，分類方式也很復雜。與動 、植物來源的蛋白酶相比，微生物來源的蛋白酶—微生物蛋白酶，因其具有培養(yǎng)簡便、產(chǎn)量豐富，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的特點而被廣泛應(yīng)用，同時菌種篩選、純化、誘變乃至重組工程菌種技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展為其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了堅實的基礎(chǔ)，目前微生物蛋白酶已經(jīng)被人們廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)業(yè)，它在食品工業(yè)方面的潛力無可估量，是國內(nèi)外科研中的一項熱門領(lǐng)域。

利用微生物產(chǎn)生蛋白酶生產(chǎn)腐乳類食品，在我國已經(jīng)有一千多年的歷史[1]，腐乳是人們喜愛的一種傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品，具有獨特的風味，蛋白質(zhì)含量極其豐富，且不含膽固醇，是一種質(zhì)構(gòu)頗似軟干酪的植物蛋白食品[2]。在貴州，畢節(jié)大方的臭豆腐更是微生物蛋白酶應(yīng)用于食品的一大杰作，被譽為貴州的十大小吃之一。與其他地方的腐乳類食品相比，其質(zhì)地酥嫩細膩，食之清爽適口，佐以辣椒、花椒、鹽末等調(diào)料，味道更為鮮美，其內(nèi)并富含蛋白質(zhì)、脂肪、糖、鈣、鐵以及維生素等有益成分，可謂是腐乳類食品中的極品，之所以其味道獨特、營養(yǎng)豐富，毛霉蛋白酶對臭豆腐風味的形成起著至關(guān)重要的作用。之前人們不斷對畢節(jié)市區(qū)臭豆腐的生產(chǎn)進行揣摩與研究。但目前，畢節(jié)市區(qū)豆腐乳類食品的研究僅限于宏觀上(如溫度、水分、發(fā)酵時間對成品的影響等)的分析，而對于其毛霉蛋白酶優(yōu)良菌株的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化少有研究。

本文對貴州畢節(jié)市區(qū)臭豆腐中的毛霉進行分離、篩選，降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品品質(zhì)具有重要意義。有利于推動食品發(fā)展及推廣本地畢節(jié)的特產(chǎn)。通過研究，對于進一步豐富毛霉蛋白酶數(shù)據(jù)庫具有理論意義，也對工業(yè)上加強新型酶制劑品種的開發(fā)和提高酶制劑的發(fā)酵水平有現(xiàn)實意義。

1 實驗內(nèi)容與方法

1.1 菌種培養(yǎng)基的制備

馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g，蔗糖20 g，水1000 mL。配制方法如下：將馬鈴薯去皮，切成約2 cm2的小塊，放入1500 mL的燒杯中煮沸30min，注意用玻璃棒攪拌以防糊底，然后用雙層紗布過濾，取其濾液加糖，再補足水至1000 mL，自然pH。

1.2 毛霉的分離與純化

無菌條件下，將滅菌后的培養(yǎng)基倒于若干培養(yǎng)皿內(nèi)搖勻放好，待凝固后，取2～3個將少許菌懸液滴于培養(yǎng)基上，用接種針畫線使其分散，倒置培養(yǎng)皿將其放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，從長有單菌落的平板中選取典型的毛霉菌落，取孢子體制成菌懸液，再平板培養(yǎng)，鏡檢，重復培養(yǎng)2～3次以分離純化毛霉。將純化了的毛霉轉(zhuǎn)接到察氏斜面上培養(yǎng)，待生長完好后置于4℃冰箱中保存。

1.3 菌懸液的制備

察氏培養(yǎng)基：蔗糖29.9926 g，NaNO32.0039 g，K2HPO41.0940g，MgSO4·7H20 0.5027g，KCl 0.5058g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0098 g，水 1000 mL，pH值7.0～7.2。

于滅菌后的三角瓶中加入無菌水100 mL，放入一定量的細玻璃珠，經(jīng)高壓蒸汽鍋內(nèi)滅菌15min后，在凈化工作臺內(nèi)，用接種針在臭豆腐上挑取菌絲放入三角瓶中，振蕩10min后備用。(臨用前配制)

1.4 不同pH值酪素溶液的配制

稱取六組均為0.5 g的酪素于小燒杯中，各加入3滴0.1 mol/L的NaOH溶液，并用玻璃棒碾溶，大約10min后加入對應(yīng)的pH溶液15 mL浸泡半小時，在40 ℃水浴中加熱攪拌至完全溶解后定容到50 mL容量瓶中，并分別編號為L7.3、L7.4、L7.5和L7.25、L7.30、L7.35備用。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

取六支250 mL滅菌的三角瓶，分別貼上標簽為50℃、pH值7.3、48 h，50℃、pH值7.4、50 h，50℃、pH值7.5、52h，另外三個分別貼上對應(yīng)的空白標簽，然后都加入100 mL的蒸餾水，用緩沖液調(diào)成對應(yīng)的pH值，加入等量洗凈、煮過的白豆腐塊，滅菌備用。

1.6 毛霉產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以溫度、培養(yǎng)基pH值、培養(yǎng)時間等因素進行(L933)正交實驗，通過測定蛋白酶活力確定優(yōu)化的發(fā)酵條件。將該毛霉產(chǎn)蛋白酶的最佳作用條件51℃、pH值7.4[5]作為參考，分別在51℃、pH值7.4附近，溫度間隔1℃，pH值間隔0.1設(shè)定為50℃，51℃，52℃和pH值7.3，pH值7.4，pH值7.5三個點作正交實驗，為了便于分析，添加作用時間為輔助因素，分別為48 h，50 h，52 h。利用正交設(shè)計軟件對測量結(jié)果進行分析，得出溫度、pH、時間共同作用時的最佳發(fā)酵條件。

在無菌條件下，除空白樣，用接種針挑選1.2保存的優(yōu)良毛霉菌落，均等量接入三角瓶內(nèi)，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱里，50℃培養(yǎng)各自對應(yīng)的時間。待達到培養(yǎng)時間時，依次拿出，用離心機8800 r/min離心分離。在貼上對應(yīng)標簽的試管中，均加入2mL離心液，再各加2 mL對應(yīng)pH值的酪素溶液，搖勻，放入40℃水浴鍋中反應(yīng)10min，立即加入加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸終止反應(yīng)，搖勻靜置10min，過濾，取1 mL濾液到新帖對應(yīng)標簽的試管中，分別加入5 mL 0.4 mol/L碳酸鈉，1 mL 1∶1稀釋的福林酚試劑，搖勻，在此恒溫鍋中恒溫顯色20min，測其吸光度并計算相對酶活力。

同理，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱里，根據(jù)正交試驗進行液體發(fā)酵，得出該蛋白酶最佳作用條件。

1.7 酶活力的計算

蛋白酶活力的測定：蛋白酶活力測定采用福林酚法[5]。并定義：在一定溫度、適當pH值條件下，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸所需的酶量為一個蛋白酶活力單位。

蛋白酶活力=A×6×N/10

其中：A—吸光度對照標準曲線得出的酪氨酸釋放量(即標準曲線回歸方程中的y值)；6：反應(yīng)液實際體積6 mL；10—反應(yīng)時間10min；N—酶液稀釋倍數(shù)(N=10)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標準曲線

配制0、10、20、30、40、50μg/mL的酪氨酸溶液，分別吸取1mL(平行樣3次)在堿性條件下與1 mL 1∶1稀釋的福林酚試劑置于40℃水浴顯色20min，在680 nm處測定吸光度，數(shù)據(jù)如表1[3-4]。

表1 酪氨酸標準曲線Table 1 Tyrosine standard curve

用吸光度平均值作橫坐標，酪氨酸濃度為縱坐標，繪制標準曲線見圖1。

圖1 酪氨酸標準曲線Fig.1 Tyrosine standard curve

由圖1可得回歸方程為：y=158.84x(R2 =0.9976)

注：R2為相關(guān)系數(shù)方程值[6]，由作圖獲得；R2值越接近于1，說明實驗數(shù)據(jù)能密集在求得的直線旁，用線性函數(shù)進行回歸比較合理，即線性關(guān)系較好。本實驗所得標準曲線線性關(guān)系較好，可以進行下一步實驗。

2.2 毛霉產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

根據(jù)實驗方法1.7，采用正交試驗考查溫度、pH值、時間對毛霉產(chǎn)蛋白酶的相對活力的影響，結(jié)果見表2。

對表2中的數(shù)據(jù)用正交設(shè)計助手IIV3.1破解版軟件進行處理，得到直觀分析見表3。

表2 酶的最佳作用條件正交設(shè)計試驗驗與結(jié)果 2Table 2 The orthogonal experiment for the best conditions of the protease 2

表3 正交試驗直觀分析表Table 3 The analysis of the orthogonal test

由表3作圖得到圖2。

圖2 溫度、pH值、時間對毛霉蛋白酶的直觀分析圖Fig.2 The intuitive analysis diagram of temperature and pH and time on the mucor protease

從圖2看出RT>RpH，即溫度對該毛霉蛋白酶的影響最大；在溫度51 ℃、pH值7.3、時間50h時為酶的最佳發(fā)酵條件。因此，我們在臭豆腐生產(chǎn)中應(yīng)嚴格注意溫度的控制。

3 結(jié)論

利用平板分離法，從臭豆腐的菌落中分離、純化出優(yōu)良的毛霉菌種，采用(L934)正交試驗法對發(fā)酵條件進行研究，確定所分離的毛霉最佳發(fā)酵條件是溫度是51 ℃、pH值7.3、時間50 h。

根據(jù)畢節(jié)市及大方縣水體系pH值進行分析，顯示出大方縣水體系pH值略高于7.0，弱堿性，而畢節(jié)市水體系pH值高于8.0，偏堿性。由此說明，在臭豆腐的風味及口感的形成上，大方縣弱堿性的水環(huán)境更有利于毛霉蛋白酶的水解，而畢節(jié)市偏堿性的水環(huán)境阻礙了毛霉蛋白酶的正常水解，使得所生產(chǎn)出的臭豆腐的風味受到影響，這可能是大方臭豆腐口感優(yōu)化于畢節(jié)市臭豆腐的原因之一。因此，若要改善畢節(jié)市臭豆腐的生產(chǎn)，則需嚴格控制其水環(huán)境的pH處于中性，溫度在51 ℃左右，以發(fā)揮毛霉蛋白酶的正常酶促水解作用。

[1] 趙雪松. 豆腐乳的一般制法[J].食品科學,1984(7): 59 - 61.

[2] 符曉靜.孫君社.微生物蛋白酶在腐乳生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進展[J].食品科學,2005(26):122-124.

[3] 林登峰,李德發(fā),陸文清.福林顯色法測定飼料用蛋白酶活力的要點分析[J].檢測技術(shù),2003(4): 29-30.

[4] 顏駿程.畢節(jié)市區(qū)臭豆腐中毛霉蛋白酶性質(zhì)的研究[D].畢節(jié):畢節(jié)學院,2010.

[5] 邵 偉,鄒 雪.毛霉3039產(chǎn)蛋白酶特性研究[J].中國調(diào)味品,2009(1): 62-63.

[6] 鄧方席,劉素純.腐乳毛霉菌種選育及產(chǎn)酶條件的研究[J].湖南農(nóng)學院學報,1995(2):56- 60.

(本文文獻格式：聶 紅，楊 姍.畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)臭豆腐質(zhì)量檢測[J].山東化工,2017,46(15):18-20.)

The Quality Testing About of the Stinky Tofu in Bijie City

NieHong1,YangShan2*

(1.The tenth Middle School of Bijie City,Guizhou Province,Bijie 551700,China;2.Chemical Engineering College,Guizhou University of Engineering Science,Bijie 551700,China)

The crude protease,produced by Mucor sp.,was extracted from strong-smelling preserved Stinky Tofu,whose length was over than 1 cm in Bijie City. The strong-smelling preserved bean curd were isolated and purified gain excellent mucor colony by platemethod. By orthogonal analyse,on mucor protease produced by liquid fermentation were studied,the Mucor protease maximum activity of conditions is temperature of 51 ℃,pH 7.30 and culture time 50h,facilitates the rapid hydrolysis of protease.

isolation purified;fermentation;orthogonal experiment;mucor protease

2016-05-19

貴州省科技廳、畢節(jié)市科技局、貴州工程應(yīng)用技術(shù)學院聯(lián)合基金項目(黔科合LH字[2015]7598)；貴州省化學工程與技術(shù)重點支持學科，貴州省煤化工工程協(xié)同創(chuàng)新中心

聶 紅(1980—)，女，貴州畢節(jié)人，中學一級，主要從事分析檢測工作；通訊作者：楊 姍(1982—)，女，彝族，碩士，副教授，貴州大方縣人，研究方向：環(huán)境微生物、蛋白質(zhì)。

TQ925+.2

A

1008-021X(2017)15-0018-03