王 蕾 袁圣楠 李 麗 齊思佳 劉倩倩 張志遠(yuǎn)

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

姜辣素滴丸的制備及對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用*

王 蕾 袁圣楠 李 麗 齊思佳 劉倩倩 張志遠(yuǎn)

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

目的 制備姜辣素滴丸并探討其對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用。方法 采用正交設(shè)計(jì)法，觀察姜辣素滴丸的基質(zhì)選擇、藥液溫度、基質(zhì)配比三因素對(duì)滴丸硬度、圓整度、拖尾情況、溶散時(shí)間的影響，進(jìn)行處方篩選。另取40只清潔級(jí)昆明小鼠，隨機(jī)分為4組：正常組、模型組、姜辣素滴丸給藥組(400 mg·kg-1·d-1)、陽性藥物聯(lián)苯雙酯對(duì)照組(150 mg·kg-1·d-1)。以白酒灌胃法(0.15 ml/10 g)建立酒精性肝損傷模型，正常組給予等量生理鹽水處理；灌胃2 h后給予相應(yīng)藥物處理，實(shí)驗(yàn)3周后檢測各實(shí)驗(yàn)組血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及肝勻漿超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量變化，同時(shí)觀察肝臟形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果 姜辣素滴丸外觀完整，溶散時(shí)間短，給藥后可明顯降低小鼠血清中ALT、AST的活性，提高肝勻漿中SOD活性，降低MDA含量，改善肝臟病理學(xué)變化。結(jié)論 姜辣素滴丸處方合理，制備簡單，對(duì)長期飲酒造成的酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗氧化作用有關(guān)。

姜辣素滴丸；制備；酒精性肝損傷；抗氧化

姜通稱生姜，屬多年生草本植物，其根莖肥厚，具有芳香味和辣味，是傳統(tǒng)的藥食兩用植物。在中醫(yī)理論中，生姜性味辛、溫，歸肺脾胃經(jīng)。用于發(fā)汗解表，溫中止吐，溫肺止咳，風(fēng)寒感冒。姜辣素是姜生物活性的主要成分，在調(diào)味品、保健食品、藥品、化妝品等行業(yè)應(yīng)用廣泛[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，它具有多種生理和藥理作用：抗氧化、抑菌、清除自由基、降低膽固醇、抗腫瘤、抗炎、保肝利膽、抗運(yùn)動(dòng)病、降血糖、抗血小板凝集等[2-4]。但姜辣素因較粘稠，化學(xué)和熱不穩(wěn)定性，使其生物利用度較低，臨床應(yīng)用受到限制。

滴丸是指固體或液體藥物與適當(dāng)物質(zhì)(一般稱為基質(zhì))加熱熔化混勻后，滴入不相混溶的冷凝液中、收縮冷凝而制成的小丸狀制劑，主要供口服使用。具有制備簡單、質(zhì)量可控，生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。因此考慮采用聚乙二醇作為基質(zhì)，將姜辣素做成滴丸，以提高生物利用度。本試驗(yàn)前期內(nèi)容主要是采用正交設(shè)計(jì)法，處方篩選，將姜辣素做成滴丸。

隨著人們生活水平的不斷提高，酒精消費(fèi)人群逐年增加，因長期大量飲酒引起的酒精性肝損傷(alcoholic liver damage, ALD)也與日俱增[7-8]。目前臨床治療酒精性肝損傷除采用戒酒，營養(yǎng)支持治療外，化學(xué)藥物治療也是其重要的治療手段。常采用聯(lián)苯雙酯、水飛薊素、美他多辛來治療酒精性肝損傷，這些藥物除了對(duì)人體自身有副作用外，對(duì)于晚期患者的治療效果也不盡如意[9]。因此，開發(fā)安全有效的預(yù)防酒精性肝損傷的藥物具有十分重要的意義。本試驗(yàn)后期內(nèi)容主要是制備酒精性肝損傷模型，初步評(píng)價(jià)姜辣素滴丸對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 健康清潔KM小鼠 (18～20 g)，由泰山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2藥品和試劑 姜辣素，購于成都瑞芬思生物科技有限公司；聯(lián)苯雙酯，購于仁濟(jì)大藥房；谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT) 試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST) 試劑盒，超氧化物歧化酶 (SOD) 試劑盒，丙二醛 (MDA) 試劑盒、考馬斯亮藍(lán)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.3儀器 BP211D型分析天平，美國Sar-torius公司產(chǎn)品；TGL20M低溫離心機(jī)，鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Bio-rad680酶標(biāo)儀；自制簡易滴丸裝置。

1.4方法

1.4.1姜辣素滴丸的制備工藝與處方篩選 根據(jù)相關(guān)資料及文獻(xiàn)，選擇聚乙二醇4000和聚乙二醇6000為基質(zhì)，以正交試驗(yàn)優(yōu)選姜辣素滴丸的基質(zhì)配比、藥液溫度以及藥物與基質(zhì)的配比選用選擇L9(33) 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)水平表

用膠頭滴管吸取適量上述除盡氣泡的姜辣素-PEG混勻熔融液，滴口距離冷卻液5 cm，控制滴速為40滴/min，均勻滴入80 cm長的液體石蠟冷凝液中，觀察滴丸的成型狀況及沉降時(shí)間，待冷凝完全，傾去冷凝液，瀝靜，收集滴丸。

1.4.2酒精性肝損傷模型的建立 取40只清潔級(jí)小鼠 (18～20 g，雌雄各半)，隨機(jī)分為4組：正常組、模型組、姜辣素滴丸給藥組、陽性對(duì)照組。正常組每日給予生理鹽水灌胃；其余3組用二鍋頭白酒灌胃，劑量為0.15 ml/10 g。白酒灌胃后，正常組及模型組不做給藥處理，其余兩組在灌酒2 h后分別給予姜辣素滴丸 (400 mg·kg-1·d-1) 和聯(lián)苯雙酯溶液(150 mg·kg-1·d-1)，每天1次，持續(xù)3周。

1.4.3生化指標(biāo)檢測 實(shí)驗(yàn)3周后，小鼠末次灌胃禁食12 h后，摘眼球取血，頸部脫臼處死，快速取出肝臟組織。一部分甲醛固定，待做病理學(xué)檢測；另一部分用冰生理鹽水制成10%的肝勻漿。檢測各實(shí)驗(yàn)組肝勻漿中SOD、MDA及血清中ALT、AST的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.4HE染色，觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)變化 快速取出肝臟組織后，4%多聚甲醛固定24 h、自來水沖洗24 h、后浸泡于75%乙醇中保存，待做病理形態(tài)學(xué)觀察時(shí)，常規(guī)脫水，石蠟包埋，HE染色。觀察各實(shí)驗(yàn)組肝組織形態(tài)的變化。

1.4.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間比較采用方差分析，以P≤0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以滴丸硬度、圓整度、拖尾情況、溶散時(shí)間為考察指標(biāo)。硬度由硬至軟分為1～5級(jí)，外形由圓整至不圓整分為1～5級(jí)，拖尾情況由好至差分為1～5級(jí)，記錄溶散時(shí)間。以硬度、圓整度、拖尾的評(píng)級(jí)和溶散時(shí)間作為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，即K=硬度評(píng)級(jí)+圓整度評(píng)級(jí)+拖尾評(píng)級(jí)+溶散時(shí)間，以K值越小越好。結(jié)果見表2。由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知最佳滴制條件為A1B3C3，即基質(zhì)聚乙二醇4000∶聚乙二醇6000=1∶1，姜辣素∶基質(zhì)=1∶6，藥液溫度為70℃時(shí)，是制備姜辣素滴丸的最佳條件。方差分析結(jié)果表明，因素C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，即藥物與基質(zhì)的配比影響最大，而基質(zhì)配比和藥液的溫度無顯著性差異。采用最佳滴制條件 A1B3C3，制取充足的姜辣素滴丸，并根據(jù)中國藥典的標(biāo)準(zhǔn)篩取符合條件的滴丸，以便進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2姜辣素滴丸對(duì)小鼠血清ALT、AST酶活性的影響 與對(duì)照組相比，模型組中ALT、AST活性明顯增高 (P<0.01)，提示酒精性肝損傷模型成功；與模型組相比，兩個(gè)給藥組小鼠血清中ALT、AST活性均降低 (P<0.01)，姜辣素滴丸給藥組降低的更為明顯，見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

表3 各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清ALT和AST酶活力的比較

注：與正常組相比▲P<0.01；與模型組相比★P<0.01。

2.3姜辣素滴丸對(duì)小鼠肝勻漿SOD、MDA含量的影響 與對(duì)照組相比，模型組中SOD活性明顯降低，MDA含量增高 (P<0.01)；與模型組相比，兩個(gè)給藥組均可升高SOD活性(P<0.01)，同時(shí)降低MDA含量(P<0.05)，姜辣素滴丸給藥組作用最為明顯。見表4。

表4 各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝勻漿中SOD、MDA水平的影響

注：與正常組相比▲P<0.01；與模型組相比★P<0.01，#P<0.05。

2.4肝臟病理形態(tài)學(xué)變化 各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟病理學(xué)的變化見圖1。與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝索紊亂，肝小葉融合，出現(xiàn)大量片狀肝細(xì)胞空泡樣變，細(xì)胞漿內(nèi)含有少量大小不一的脂肪空泡，中央靜脈周圍可見大量炎細(xì)胞浸潤，姜辣素滴丸給藥組和陽性對(duì)照組小鼠肝臟多見索條狀排列的肝細(xì)胞，肝小葉較多的保存完整，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕。

正常對(duì)照組 (HE, 100×)

模型組 (HE, 100×)

姜辣素滴丸給藥組 (HE, 100×)

3 討 論

本研究采用正交設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)探討了姜辣素滴丸的最佳成型條件，最終確定聚乙二醇4000∶聚乙二醇6000=1∶1，姜辣素∶基質(zhì)=1∶6，藥液溫度為70℃時(shí)，得到的滴丸外形質(zhì)量好，溶散時(shí)間短，質(zhì)量無顯著性差異，此制備方法簡單合理，穩(wěn)定可行。姜辣素滴丸的制備克服了藥物本身溶解性差，生物利用度低的缺點(diǎn)，滴丸劑中藥物分散在基質(zhì)中，可有效改善難溶性藥物在體內(nèi)的溶解和吸收，具有速效，提高生物利用速度的特點(diǎn)。

人類飲酒之風(fēng)盛行已久，適當(dāng)?shù)娘嬀茖?duì)身體有一定的健康效應(yīng)，但長期過量飲酒嚴(yán)重危害著人們的身體健康。酒精性肝損傷是其最主要的表現(xiàn)之一。初期表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化，嚴(yán)重者可發(fā)展為肝癌。所以有關(guān)預(yù)防和治療酒精性肝損傷的課題引起了廣泛的關(guān)注，但有關(guān)姜辣素滴丸對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用還未見報(bào)道，具體機(jī)制也尚不明確。本課題采用連續(xù)灌酒的方式成功建立小鼠酒精性肝損傷模型，觀察姜辣素滴丸對(duì)其干預(yù)作用并初步探討作用機(jī)制。

肝臟因機(jī)體攝入大量酒精受損時(shí)，會(huì)導(dǎo)致線粒體功能的變化或喪失，使存在于細(xì)胞漿和線粒體中的ALT、AST釋放到血清中。臨床上常通過測定ALT、AST的活力來作為肝細(xì)胞損傷的特異性指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)灌酒3周后，模型組小鼠血清中ALT、AST活性水平明顯升高，同時(shí)呈現(xiàn)出肝臟病理學(xué)的變化，證實(shí)小鼠酒精性肝損傷模型建立成功。從氧化應(yīng)激和抗氧化指標(biāo)分析，觀察到模型組小鼠肝勻漿中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量增加，SOD活性下降，此變化結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。我們知道，SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是清除自由基的首要物質(zhì)，防止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。MDA作為機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，具有細(xì)胞毒性，其含量可以反映組織中自由基的含量和組織細(xì)胞受到自由基攻擊即脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度。本研究造模的同時(shí)使用姜辣素滴丸和聯(lián)苯雙酯藥物進(jìn)行干預(yù)，實(shí)驗(yàn)3周后結(jié)果顯示，小鼠血清中ALT、AST水平均下降，SOD活力增加，MDA含量降低，同時(shí)肝細(xì)胞脂肪空泡減少，肝小葉保存完整，炎癥改善。以上表明藥物干預(yù)后對(duì)小鼠酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用，對(duì)肝臟早期出現(xiàn)的病理形態(tài)學(xué)變化有一定的抑制發(fā)展甚至逆轉(zhuǎn)作用，相比之下，姜辣素滴丸比陽性藥物的干預(yù)作用更強(qiáng)。其作用機(jī)理與清除體內(nèi)自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。

總之，本研究證實(shí)姜辣素滴丸對(duì)酒精代謝引起的小鼠體內(nèi)氧化和抗氧化的平衡失調(diào)有一定的保護(hù)作用，可降低小鼠血清中ALT、AST活性，清除自由基，改善肝臟病理學(xué)變化。其機(jī)制與姜辣素滴丸的抗氧化活性有關(guān)，提高抗氧化酶SOD活性，抑制過氧化作用，從而減輕酒精對(duì)小鼠肝臟的損害。但由于時(shí)間原因，本研究中姜辣素滴丸沒有設(shè)置不同劑量進(jìn)行比較，所以有關(guān)最佳劑量和更深入的作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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Protective effect of gingerol dropping pills against alcoholic liver injury in mice

WANG Lei YUAN Sheng-nan LI Li QI Si-jia LIU Qian-qian ZHANG Zhi-yuan

(Taishan Medical University, Taian 271016, China)

Objective:To study the protective effect of gingerol dropping pills against alcoholic liver injury in mice. Methods: The prescription was selected by orthogonal design method and the effect of the option and ratio of ground substance, the temperature of drug. The hardness, circular degree，the tail formation and the dissolution time were studied. Totally 40 KM mice were randomly divided into control group, model group, gingerol dropping pill group (400 mg·kg-1·d-1) and positive control group (bifendate, 150 mg·kg-1·d-1) of 10 mice each. The mice from the model and two drug groups were administrated with liqueur (0.15 ml·g-1·d-1) daily by gavage for 3 weeks, Two hours later, drug group mice were treated corresponding gingerol dropping pill and bifendate. Meanwhile, the control group were gavaged same amount of normal saline. Finally, when the model of acute alcoholic liver injury was established on the 22st day, Biochemical indicators of ocular blood in mice were observed. We also observed the change of liver morphology. Results: Under optimum conditions, we can obtain dropping pills having circular shape, touching with hardness and short dissolution time. The levels of alanine transaminase (ALT), glutamic-oxaloacetic transaminase (AST) and malondialdehyde (MDA) in drug groups were obviously decreased, While the activity of Superoxide dismutase (SOD) were increased. In addition, compared with the model group, drug groups attenuated or even reversed hepatic pathological changes. Conclusion: The prescription of gingerol dropping pills was reasonable, and the preparation process was simple. Gingerol dropping pills can protect liver from alcoholic liver injury to some extend, and the mechanism may be related to its antioxidant effect.

gingerol dropping pills; preparation; alcoholic liver injury; antioxidation.

泰安市大學(xué)生科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2015D064)；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目(201510439078)；泰安市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015NS2104)。

王蕾 ，女，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師。

R961

：A

：1004-7115(2017)09-0996-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.09.012

2017-06-03)