王曉華，張玉娟，周曉慧，徐 倩

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）

靶向干擾ARTN對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖能力的影響*

王曉華1，張玉娟2△，周曉慧1，徐 倩1

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）

目的:通過RNA干擾技術(shù)靶向抑制ARTN基因在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)，探討抑制ARTN基因?qū)shikawa細(xì)胞增殖能力的影響。方法：體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，以pGPU6/GFP/Neo為載體構(gòu)建ARTN基因的短發(fā)夾RNA（pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA）干擾質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，應(yīng)用Western Blot法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞ARTN蛋白的表達(dá)情況，CCK法檢測Ishikawa細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果：pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA干擾質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率為80%；轉(zhuǎn)染后48h，干擾組Ishikawa細(xì)胞ARTN蛋白的表達(dá)水平明顯低于陰性對照組和正常組（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染后48h、72h、96h，干擾組Ishikawa細(xì)胞的增殖活性明顯低于陰性對照組和正常組（P＜0.05）。結(jié)論：靶向干擾ARTN基因可抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的增殖能力。

ARTN基因是膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一員，對神經(jīng)系統(tǒng)的生長及發(fā)育具有支持、營養(yǎng)的功能[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，ARTN基因不僅參與神經(jīng)損傷后的修復(fù)過程[2-3]，并且對多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到一定的調(diào)控作用。但ARTN基因?qū)Σ煌[瘤細(xì)胞增殖作用的影響不同，對乳腺癌[4]、非小細(xì)胞肺癌[5]、食管癌[6]細(xì)胞的增殖有明顯促進(jìn)作用，而對胰腺癌[7]細(xì)胞的增殖無明顯影響。本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制ARTN基因在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)，探討ARTN基因?qū)shikawa細(xì)胞增殖作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；胎牛血清（FBS）、PRMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；兔抗人ARTN單克隆抗體（英國艾博抗貿(mào)易有限公司）；鼠抗人β-actin多克隆抗體（美國Affinity Biosciences公司）；CCK試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）；pGPU6/ GFP/Neo-ARTN shRNA（蘇州吉瑪基因股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：Ishikawa細(xì)胞用含10% FBS的PRMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%時傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞接種于6孔板，密度為4×105個/ml，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞豐度為70%-90%。按Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染試劑的配制。實驗分為pshRNA-A干擾組（轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA干擾質(zhì)粒），pshRNA-NC陰性對照組（轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo空載體質(zhì)粒）和正常組（正常血清培養(yǎng)，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒）。轉(zhuǎn)染6h后棄去原培養(yǎng)基，更換為含10% FBS的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24h后熒光顯微鏡下觀察并計算轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 Western Blot法檢測Ishikawa細(xì)胞ARTN蛋白的表達(dá)情況：轉(zhuǎn)染后48h，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量后，進(jìn)行凝膠電泳。12%分離膠和5%濃縮膠分離蛋白并電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗（ARTN 1：1000）4℃孵育過夜，二抗（1：3000）孵育1h，ECL超敏化學(xué)發(fā)光液顯影。應(yīng)用Quantity-one 4.6.2圖像分析軟件行光密度分析，用目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的光密度比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.4 CCK法檢測細(xì)胞增殖能力：收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4×104/ml，均勻接種至96孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔，同時設(shè)置調(diào)零孔。分別于轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h、96h加入CCK原液10μl，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2.5h，酶標(biāo)儀測定450nm處吸光度值（OD值），取OD平均值并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染24h后熒光顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)弱不等的綠色熒光，計算得出轉(zhuǎn)染效率為80%[轉(zhuǎn)染效率（%）=暗視野綠色熒光細(xì)胞數(shù)/明視野細(xì)胞數(shù)]。見圖1：

圖1 Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況（熒光顯微鏡，×200）（A.明視野，B.暗視野）

2.2 Ishikawa細(xì)胞ARTN蛋白的表達(dá)情況 轉(zhuǎn)染ARTN干擾質(zhì)粒后48h，pshRNA-A干擾組、pshRNA-NC陰性對照組和正常組ARTN蛋白的相對表達(dá)量分別為0.346±0.021、1.053±0.024、1.080±0.034，pshRNA-A干擾組ARTN蛋白的表達(dá)明顯低于其它兩組（P＜0.05）。

2.3 CCK法檢測細(xì)胞增殖能力 轉(zhuǎn)染ARTN干擾質(zhì)粒后24h，各組Ishikawa細(xì)胞增殖活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染ARTN干擾質(zhì)粒后48h、72h、96h，pshRNA-A干擾組細(xì)胞的增殖活性明顯低于陰性對照組和正常組（P＜0.05）。見附表、圖2：

附表 各組Ishikawa細(xì)胞的增殖情況（±s，n=6）

附表 各組Ishikawa細(xì)胞的增殖情況（±s，n=6）

與陰性對照組、正常組比較：*P＜0.05

組別 24h 48h 72h 96h pshRNA-A干擾組 0.169±0.036 0.348±0.044*0.589±0.104*1.044±0.039*pshRNA-NC陰性對照組 0.178±0.035 0.545±0.055 0.923±0.153 1.182±0.087正常組 0.179±0.039 0.558±0.035 0.956±0.128 1.192±0.042

圖2 各組Ishikawa細(xì)胞的生長曲線

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。腫瘤發(fā)生原因大多是由于機(jī)體在基因水平上失去了對細(xì)胞生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞異常克隆性增殖，并伴有不同程度的分化異常。近些年的研究發(fā)現(xiàn)[8]，ARTN基因在人類多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖能力，而ARTN對子宮內(nèi)膜癌影響的研究報道很少。

本研究利用ARTN干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察計算轉(zhuǎn)染效率為80%，轉(zhuǎn)染效果可靠。轉(zhuǎn)染后48h Western Blot法檢測顯示干擾質(zhì)粒可明顯抑制Ishikawa細(xì)胞ARTN蛋白的表達(dá)。CCK法發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染24h各組細(xì)胞增殖水平無明顯差異，可能轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的時間較短，尚未能發(fā)揮干擾作用；隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，轉(zhuǎn)染后48h、72h、96h，干擾組細(xì)胞的增殖水平明顯低于陰性對照和正常組。本研究提示干擾ARTN基因可顯著抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的增殖能力。

雖然目前對ARTN基因的研究尚處于起步階段，但隨著對其研究的不斷深入，ATRN基因可能為惡性腫瘤的病因研究及治療提供新的研究方向。

[1]Baloh RH, Tansey MG, Lampe PA, et al. Artemin, a novel member of the GDNF ligand family, supports peripheral and central neurons and signals through the GFRalpha3-RET receptor complex[J]. Neuron, 1998, 21(6): 1291-1302.

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[4]Kang J, Perry JK, Pandey V, et al. Artemin is oncogenic for human mammary carcinoma cells[J]. Oncogene, 2009, 28(19): 2034-2045.

[5]Tang JZ, Kong XJ, Kang J, et al. Artemin-stimulated progression of human non-small cell lung carcinoma is mediated by BCL2[J]. Mol Cancer Ther, 2010, 9(6): 1697-1708.

[6]李書軍，和宇崢，王有富，等.Artemin和基質(zhì)金屬蛋白酶2在食管鱗癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].廣東醫(yī)學(xué)，2010，31(19)：2567-2569.

[7]古賽，黃妙興.Artemin對體外胰腺癌細(xì)胞增殖與侵襲影響的實驗研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，35(12)：1814-1816.

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(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)欄目編輯：陳志宏)

EFFECTS OF TARGETED INTERFERENCE OF ARTN ON PROLIFERATION OF ENDOMETRIAL CANCER ISHIKAWA CELLS

WANG Xiao-hua, ZHANG Yu-juan, ZHOU Xiao-hui, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the effects of inhibiting ARTN gene by targeted interference of ARTN gene on proliferation of endometrial cancer Ishikawa cells.Methods:Short hairpin RNA (pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA) interference plasmid of ARTN gene was constructed using pGPU6/GFP/Neo as carrier, and transfected into human endometrial cancer Ishikawa cells by liposome method. The transfection eff i ciency was observe under fl uorescence microscope; Western Blot was used to detected ARTN protein expression in Ishikawa cells after transfection; CCK method to detect the proliferative activity of Ishikawa cells.Results:The pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA interference plasmid was successfully transfected into Ishikawa cells and the transfection eff i ciency was 80%. 48h after transfection, the ARTN protein expression of Ishikawa cells in interference group was obviously lower than negative control group and normal group (P＜0.05). 48h, 72h and 96h after transfection, the proliferative activity of Ishikawa cells in interference group was obviously lower than negative control group and normal group (P＜0.05).Conclusions:Targeted interference of ARTN gene can inhibit the proliferative activity of endometrial cancer Ishikawa cells.

Endometrial cancer; ARTN gene; RNA interference; Proliferation

R737.33

A

1004-6879（2017）05-0368-03

2016-12-03）

* 河北省科技廳科技支撐項目（14277766D）

△ 通訊作者

【關(guān)鍵詞】 子宮內(nèi)膜癌；ARTN基因；RNA干擾；增殖