吳 劍，張 葉

（安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽蕪湖 241000）

在廉價(jià)高分子材料表面采用化學(xué)鍍金法制備接觸式電導(dǎo)檢測(cè)器及其在PCR產(chǎn)物分析中的初步應(yīng)用*

吳 劍，張 葉

（安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，安徽蕪湖 241000）

化學(xué)鍍金；接觸式電導(dǎo)檢測(cè)器；PCR產(chǎn)物分析

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）微芯片是運(yùn)用多種方法在硅片、硅橡膠等材料上加工微管道、微反應(yīng)室等，實(shí)現(xiàn)芯片上的快速PCR擴(kuò)增，具有快速、高效、試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，是近年生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[1-2]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為核酸，其檢測(cè)方法有熒光分光光度法、定量PCR法和數(shù)字PCR拷貝數(shù)計(jì)數(shù)法等[3-6]，但均需用到較為龐大的檢測(cè)儀器，因此便攜性差。電化學(xué)方法儀器便攜性好，如果能直接作為PCR微芯片的檢測(cè)元件能明顯提高微芯片的便攜性，可為在一些特殊場(chǎng)所，如中藥的野外檢測(cè)等方面提供技術(shù)支持。為此，本研究采用化學(xué)鍍金-轉(zhuǎn)移法制作了接觸式電導(dǎo)檢測(cè)器，并將其應(yīng)用于鳳丹皮PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)中，效果較好。該檢測(cè)器雖然檢測(cè)靈敏度不高，但是制作成本低廉、儀器的便攜性好，可應(yīng)用于上述特殊場(chǎng)所進(jìn)行藥材的初步篩查，因此具有一定的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)告如下：

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑、用品和儀器 聚二甲基硅氧烷(PDMS)Sylgard 184，Dow Corning(Midland, MI,美國)公司；HAuCl4，上海化學(xué)試劑有限公司；甲醛，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖，上海生物科學(xué)與技術(shù)有限公司；KHCO3，溫州化學(xué)試劑廠；透明環(huán)氧樹脂水晶膠（綠循化工商行，江蘇，昆山）；E625型硅橡膠，深圳紅葉杰公司（深圳，中國）。1×TBE緩沖溶液：分別稱取Tris 10.8g、Na2B4O7?2H2O 0.744g、 硼酸5.5g置于燒杯中，加50ml水?dāng)嚢枞芙猓D(zhuǎn)移到100ml容量瓶中搖勻、定容，0.45μm濾膜過濾，超聲去氣備用，溶液pH=8.7。維修佬焊錫絲0.2mm，淘寶網(wǎng)。所用試劑除特別標(biāo)明外，均為分析純；所有試劑均用18Mcm的Millipore水配制。

1.2 硅橡膠表面化學(xué)鍍金條件研究 雖有研究者[7]在PDMS表面進(jìn)行了化學(xué)鍍金研究，且該方法環(huán)保性好，但PDMS較為昂貴。本研究使用廉價(jià)的E625型硅橡膠，在其表面進(jìn)行了化學(xué)鍍金的配方研究。

在一塊固化后的E625型硅膠上打孔、清洗干凈、烘干，緊密貼合在另外一片固化后的E625型硅膠表面，所打小孔作為化學(xué)鍍金槽（見圖1a）。鍍液所用試劑包括：主鹽，1%氯金酸；還原劑，2%葡萄糖或0.3%甲醛水溶液或1%抗壞血酸；緩沖溶液，20%碳酸氫鉀。將主鹽、一種還原劑、緩沖溶液和水按照正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出的不同鍍液配方進(jìn)行調(diào)配、混勻，注射到上述鍍金槽內(nèi)，同一配方的鍍液重復(fù)注射到5個(gè)不同的槽內(nèi)，視頻監(jiān)控鍍金過程，完成后用目測(cè)法觀察鍍層情況（見圖1b），用萬用表考察鍍層的導(dǎo)電性能并作出評(píng)價(jià)。

圖1 化學(xué)鍍金工藝研究槽化學(xué)鍍金及結(jié)果

1.3 集成電導(dǎo)電極微芯片的制作 將少量硅橡膠按照最佳單體比例，混合傾注到培養(yǎng)皿的底部，并覆蓋培養(yǎng)皿的整個(gè)底部，硅橡膠厚度約為0.1mm，保持底部水平靜置1小時(shí)，待基本固化；將用焊錫絲、面粉制備的微管道模板放置到上述硅橡膠的表面，繼續(xù)靜置約1小時(shí)待硅橡膠完全固化。此時(shí)，部分焊錫絲模板嵌入固化后的硅橡膠內(nèi)。

將熱熔膠用熱熔膠槍加熱澆筑在在上述模板表面，待其固化后剝離獲得帶管道的熱熔膠模板，并且該模板可重復(fù)使用。

硅橡膠按照最佳單體比例傾倒在上述熱熔膠模板內(nèi)，待硅橡膠固化制備硅橡膠陽模。在硅橡膠陽模下端凸起的陽模適當(dāng)位置的兩邊，用固化后的PDMS塊圍成電導(dǎo)電極的形狀，在PDMS塊和管道凸起部分組成的兩個(gè)圍堰內(nèi)，分別注入最佳比例的化學(xué)鍍金液，靜置待形成鍍金層。

將水晶膠（由A、B兩組分組成）按A：B=3:1的比例混合均勻，傾倒在鍍金后的硅橡膠模板表面，待固化后剝離獲得帶管道和電導(dǎo)電極的水晶膠基電泳芯片下片。將PDMS按照單體：固化劑=10：1的比例配置混合均勻傾倒在另一培養(yǎng)皿中，靜置，氣泡脫凈后60℃加熱1小時(shí)，待固化后切割成所需要的形狀作為上片，在PDMS上片的適合位置打孔，形成進(jìn)樣口、廢液口等。將上下片貼合在一起，制成集成電導(dǎo)電極的復(fù)合電泳芯片（整個(gè)制備過程見圖2）。在兩個(gè)電導(dǎo)電極后端引出引線，連接在EZ-1電導(dǎo)率測(cè)試筆的兩個(gè)電極上。

圖2 集成電導(dǎo)電極微芯片制作過程示意圖

1.4 使用電泳芯片檢測(cè)鳳丹皮PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 鳳丹皮DNA提取物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物引入上述自制集成電導(dǎo)電極微芯片的進(jìn)樣口，在1×TBE緩沖溶液下電泳分離，用電導(dǎo)率儀進(jìn)行檢測(cè)，用監(jiān)控?cái)z像頭監(jiān)控、記錄數(shù)據(jù)的變化，所得結(jié)果整理后獲得電泳曲線。

2 討論

2.1 化學(xué)鍍金條件的研究 研究發(fā)現(xiàn)，配方甲醛、碳酸氫鉀、氯金酸、水比例為1:0.5:1.5:1，硅橡膠單體A:B=1:0.8時(shí)化學(xué)鍍成功率高，可出現(xiàn)光亮的化學(xué)鍍層，且導(dǎo)電性能良好。另研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)鍍金時(shí)溫度升高化學(xué)鍍所需時(shí)間減少，但當(dāng)溫度超過35℃時(shí)難以生成化學(xué)鍍層，原因可能是在該溫度下鍍液中水分蒸發(fā)嚴(yán)重導(dǎo)致鍍液不穩(wěn)定。因此，在施鍍時(shí)應(yīng)控制反應(yīng)溫度在25℃左右。

2.2 檢測(cè)鳳丹皮PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 鳳丹皮PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳曲線見圖3，可見電泳芯片的響應(yīng)數(shù)據(jù)（圖3）出現(xiàn)了一些較為明顯的響應(yīng)，可確定是擴(kuò)增產(chǎn)物的響應(yīng)（與常規(guī)的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳法獲得的響應(yīng)對(duì)比，圖3）。

圖3 鳳丹皮PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳曲線

3 小結(jié)

本研究利用硅橡膠表面化學(xué)鍍金法制備了接觸式電導(dǎo)檢測(cè)器，并用于檢測(cè)了鳳丹皮的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。該芯片制備過程簡(jiǎn)單、成本低廉，制備的芯片可應(yīng)用在PCR產(chǎn)物的檢測(cè)中，對(duì)中藥材的初步篩查等有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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(技術(shù)方法欄目編輯：張 健)

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1004-6879（2017）05-0417-02

2016-12-21）

* 安徽省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（KJ2012B081），2014年高校優(yōu)秀青年人才支持計(jì)劃（皖教秘人[2014]181號(hào)）