柏 玥，程佳慧，戈福星，孔德成，潘海峰，李艷榮

（承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北承德 067000）

液-質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定不同產(chǎn)地山楂葉中4種成分的含量*

柏 玥，程佳慧，戈福星，孔德成，潘海峰，李艷榮△

（承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北承德 067000）

山楂葉；液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)；含量測(cè)定

山楂葉為薔薇科山楂屬植物山里紅Grataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Grataegus pinnatifida Bge.的干燥葉，主要含有黃酮類和有機(jī)酸等成分，具有活血化瘀、理氣通脈、化脂降濁之功效[1-2]。近年來(lái)，采用HPLC-UV測(cè)定山楂葉中一個(gè)或多個(gè)黃酮類成分時(shí)有報(bào)道[3-4]，所涉及到的定量指標(biāo)只能針對(duì)牡荊素鼠李糖苷等紫外吸收較強(qiáng)、含量較高的成分，但測(cè)定表兒茶素這樣紫外吸收較弱且含量較低的成分比較困難。由于MS具有高度的靈敏度，使用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)較易測(cè)得一些微量成分和紫外吸收弱的化合物。為此，本研究采用HPLCMS結(jié)合MRM模式，對(duì)不同產(chǎn)地山楂葉中4種成分（包括紫外吸收弱的表兒茶素）進(jìn)行了含量測(cè)定，以期為山楂葉的質(zhì)量控制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 Series高效液相色譜儀，6310型質(zhì)譜儀，ESI離子源，十萬(wàn)分之一電子分析天平，KQ-700型超聲波清洗器。

對(duì)照品：表兒茶素（批號(hào)：151107）、金絲桃苷（批號(hào)：120105）、牡荊素鼠李糖苷（批號(hào)：151024）、牡荊素葡萄糖苷（批號(hào)：151103），上海久知化學(xué)品商行。乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

山楂葉：河北（S1-S15）、山東（S16-S20）、湖北（S21）、遼寧（S22）、河南（S23-S24）、江蘇（S25-S26）、四川（S27）、山西（S28-S30）、浙江（S31）、安徽（S32-S33）共33批，經(jīng)承德民族師范學(xué)院進(jìn)行了鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Poroshell 120 SB-C18（2.1mm100mm，2.7μm）；以0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫：0-10-25-35-40-41-50min，A：90%-82%-80%-80%-40%-10%-10%，B：10%-18%-20%-20%-60%-90%-90%；流速0.15ml/min，進(jìn)樣量1μl，檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，柱溫30℃。質(zhì)譜條件：大氣壓電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，參數(shù)見表1。N2壓力20psi，干燥氣流速12.0L/min，干燥氣溫度350℃。

表1 4種成分MRM模式參數(shù)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備：準(zhǔn)確稱取各對(duì)照品，用甲醇制

得含表兒茶素、金絲桃苷、牡荊素鼠李糖苷和牡荊素葡萄糖苷濃度分別為0.023、0.020、0.142和0.074mg/ml的貯備液。

2.2.2 供試品溶液的制備：精密稱定山楂葉粉末0.5g，置具塞三角瓶，精密加入25ml 60%甲醇溶液，稱重，超聲提?。?00W，40kHz）30min，放置室溫，稱重并補(bǔ)足失重，提取液離心10min（12000r/min），過(guò)0.20μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察：精密吸取制備的貯備液，倍比稀釋法制備系列對(duì)照品溶液，各進(jìn)樣1μl。表兒茶素、金絲桃苷、牡荊素鼠李糖苷和牡荊素葡萄糖苷的線性方程分別為：Y=5.60×104X-2.75×104，Y=1.48×105X+1.65×105，

Y=6.58×104X+8.01×105和Y=6.31×104X+4.63×104，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999，說(shuō)明4種成分的線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn)：取含5.75?g/ml表兒茶素、5.00?g/ml金絲桃苷、35.5?g/ml牡荊素鼠李糖苷、18.5?g/ml牡荊

素葡萄糖苷的混合對(duì)照品溶液1μl，進(jìn)樣6次，測(cè)定各離子對(duì)峰面積。4種成分離子對(duì)峰面積的RSD值均低于3.0%，表明方法的精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取山楂葉（S8），制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48h進(jìn)樣測(cè)定。4種成分離子對(duì)峰面積的RSD值均低于2.5%，說(shuō)明樣品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)：取山楂葉（S8）細(xì)粉6份，每份0.5g，按2.2.2的方法制備供試品溶液。測(cè)得4種成分含量的RSD值均低于2.3%，表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.3.5 回收率試驗(yàn)：取山楂葉（S8）6份，每份0.25g，精密加入4種對(duì)照品（加入量為相當(dāng)于0.25g樣品中所含有的量），得表兒茶素、金絲桃苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素葡萄糖苷的回收率分別為101.7%、99.4%，101.3%、103.8%。

2.3.6 樣品測(cè)定：取33批山楂葉分別制備供試品溶液，按照2.1的條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2：

表2 33批樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）

3 討論

本研究采用LC-MS法對(duì)10個(gè)產(chǎn)地33批山楂葉進(jìn)行了4個(gè)成分的含量測(cè)定，其中以河北、山東兩產(chǎn)地為主。河北產(chǎn)山楂葉4個(gè)成分含量范圍為0.00-0.94mg/g、0.10-2.93mg/g、0.03-6.36mg/g、0.01-3.95mg/g，山東產(chǎn)山楂葉4個(gè)成分含量范圍為0.00-0.85mg/g、0.29-2.23mg/g、0.16-3.81mg/g、0.03-0.84mg/g。33批樣品中部分樣品檢測(cè)不到表兒茶素，其余3種成分為山楂葉的主要成分，各批樣品均能檢測(cè)到，但含量有較大差別，可能與各地域條件、品種有關(guān)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015.

[2]王領(lǐng)弟,李艷榮,張曉峰,等.山楂葉指紋圖譜研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(19):74-78.

[3]王肖,杜義龍,趙勝男,等.承德產(chǎn)山楂葉中總黃酮和5種黃酮類成分含量的動(dòng)態(tài)分析[J] 中.國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué),2013,19(17): 171-175.

[4]崔鳳俠,吳成國(guó),李賽穎,等.山楂葉提取物的指紋圖譜研究[J].華西藥學(xué)雜志,2014,29(1):66-69.

R284

A

1004-6879（2017）05-0436-03

2017-04-07）

* 河北省高校重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助

△ 通訊作者