閆 炎，孟凡茹，魏語澤，張 昊，趙 偉，裴志花，王 開，胡桂學

（吉林農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，吉林長春 130118）

緊密連接是腸上皮細胞間的主要連接方式，不僅能阻礙外界病原體入侵，還能選擇性地調(diào)節(jié)小分子物質(zhì)和離子進入體內(nèi)，對維持上皮細胞的正常生理功能發(fā)揮重要作用。緊密連接結(jié)構(gòu)主要是以Claudin家族為核心，通過與Occludin家族、ZO家族、膜脂等之間的機械力動態(tài)地驅(qū)動緊密連接的組裝，保證緊密連接結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。腸道的緊密連接結(jié)構(gòu)一旦被破壞，就會引起腸腔內(nèi)有害物質(zhì)及外來病原體的滲透，進而引起炎癥反應及黏膜系統(tǒng)的紊亂，引發(fā)多種腸道疾病。目前已有動物試驗證明，在由病原體引起的腸細胞感染中，能夠檢測到相關緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)及表達的變化，進而破壞腸道黏膜完整性。本文綜述了腸道緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控通路的研究進展，歸納了由緊密連接改變引起的各種腸道疾病，為緊密連接的后續(xù)研究和尋找腸道疾病的治療方案提供一定的理論基礎。

1 緊密連接的結(jié)構(gòu)

緊密連接為多種蛋白相互作用下形成的復合結(jié)構(gòu)，位于上皮頂端兩細胞間，其結(jié)構(gòu)可以通過電子顯微鏡觀察到。在超薄切片上觀察，緊密連接表現(xiàn)為相鄰質(zhì)膜緊密貼合的區(qū)域，其中相鄰質(zhì)膜能夠部分融合。而在冷凍復型電鏡下，它們表現(xiàn)為纖維網(wǎng)絡狀（即緊密連接鏈）每條緊密連接鏈與相鄰細胞相對膜中的另一條緊密連接鏈橫向結(jié)合，形成“成對的”緊密連接鏈。緊密連接是一種高度動態(tài)的結(jié)構(gòu)，通過對緊密連接蛋白的定位和表達，來適應不斷變化的環(huán)境條件，對維持細胞屏障的完整性有重要意義。其中，Occludin家族、Claudin家族以及ZO家族是構(gòu)成細胞間緊密連接的重要蛋白分子。

2 緊密連接的組成

2.1 Occludin家族 Occludin是最早被鑒定出的緊密連接跨膜蛋白，屬于含Marvel結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)家族，大小為65 ku，包含4個跨膜結(jié)構(gòu)域，1個細胞內(nèi)小環(huán)，2個細胞外環(huán)，以及細胞內(nèi)定位的C和N末端。Occludin的N端有助于維持緊密連接的完整性，而C端結(jié)構(gòu)域富含潛在的磷酸化位點，能與激酶和磷酸酶相互作用。此外，Marvel基序、C端和ZO蛋白家族共同決定了Occludin是形成順式二聚體結(jié)構(gòu)還是低聚結(jié)構(gòu)。其中，Occludin與ZO蛋白家族的相互作用還決定了Occludin在緊密連接中的遷移和定位，影響了腸道的屏障功能。

2.2 Claudin家族 1988年，Claudin被Furuse等首次發(fā)現(xiàn)，并證明了過表達的可以在成纖維細胞中重建緊密連接。隨后，通過基因敲除去除或用Claudin結(jié)合的產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素片段處理可以減少緊密連接的形成，進一步證明了Claudin是構(gòu)成緊密連接的一部分。隨著對Claudin的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)小腸上皮細胞中存在多個Claudin亞型。目前，已經(jīng)確認了Claudin蛋白家族的27名成員，其大小在20～27 ku，由4個跨膜區(qū)、2個胞外環(huán)和1個細胞質(zhì)羧基尾巴組成。Claudin蛋白家族在細胞間的兩親性使其產(chǎn)生屏障或空隙，從而能夠選擇性地滲透離子，是跨膜運輸?shù)闹饕獩Q定因素。

2.3 ZO家族 除跨膜蛋白外，緊密連接還由胞質(zhì)蛋白ZO家族組成，這是一種重要的接頭蛋白，它將Claudin、Occludin和Tricellulin等跨膜蛋白與細胞骨架連接起來，從而使蛋白質(zhì)復合物能夠聚集到緊密連接的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。目前已發(fā)現(xiàn)3種ZO蛋白的異構(gòu)體（ZO-1、2、3），它們大小在220 ku左右，都具有3個PDZ結(jié)構(gòu)域、1個SH3結(jié)構(gòu)域和1個GUK結(jié)構(gòu)域。除了緊密連接，ZO蛋白還在基于Cadherin家族的黏附連接中被發(fā)現(xiàn)，影響著細胞的增殖、遷移和凋亡。ZO-1和ZO-2還能與Claudin直接結(jié)合并定位。Phua等研究證明，ZO-1、ZO-2缺失的細胞不能形成緊密連接。ZO-1是ZO蛋白家族中最早被發(fā)現(xiàn)的胞質(zhì)蛋白，除了能夠協(xié)調(diào)緊密連接的形成，它還能與共同參與上皮細胞頂基極性的建立和維持。有研究顯示，敲除小鼠基因會導致aPKC和ZO-1的錯誤定位，從而破壞緊密連接復合體的穩(wěn)定性。

3 緊密連接的功能

3.1 維持腸屏障功能完整 緊密連接蛋白定位和表達的異常是腸屏障通透性改變的重要標志，腸屏障通透性改變則會引發(fā)一系列腸道疾病，如胃腸炎。其中，病毒感染是胃腸炎最常見的原因，超過60%的腹瀉癥狀都與病毒感染有關。當仔豬感染豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）時，小腸上皮細胞的緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞。Zong等通過觀察PEDV感染仔豬的緊密連接蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)和在維持腸上皮細胞的完整性和抵御PEDV感染方面發(fā)揮著重要作用。Luo等的研究還證明了Occludin參與了PEDV的入侵。此外，有研究利用淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒（Lymphocytic Choriomeningitis Virus，LCMV）感染小鼠，這種病毒可以在腸內(nèi)造血細胞和間充質(zhì)細胞中長期復制，通過用FITC標記4-kD葡聚糖后，發(fā)現(xiàn)腸道通透性明顯增加，并且病毒感染引起了編碼Claudin-23和PALS相關的緊密連接蛋白的基因顯著下調(diào)。此外，I型IFN信號增強LCMV感染小鼠腸上皮細胞通透性和免疫細胞的募集，下調(diào)緊密連接相關基因的表達，促進腸道菌群移位，并增強了CD8 T細胞的應答。Ding等發(fā)現(xiàn)，通過其細胞外環(huán)ECL2和豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒的表面蛋白GP3之間能相互作用來中和病毒，阻礙病毒的吸收和感染，為研究新的抗病毒策略提供了參考。

除病毒感染外，細菌感染也是引起腸道屏障損傷的重要影響因素之一。如革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的促炎性脂多糖被認為是腸漏時炎癥發(fā)生的關鍵因素。在正常情況下，腸上皮可以防止促炎性脂多糖移位，但在飲食誘導肥胖（DIO）小鼠模型中，循環(huán)中的脂多糖水平較高，周圍組織中的炎癥程度較低。這表明腸道微生物區(qū)系中促炎性脂多糖水平的升高可能反過來通過增加跨上皮滲透性而加劇低度炎癥的狀態(tài)，從而促進更多的促炎性脂多糖轉(zhuǎn)移到循環(huán)中。此外，與正常組小鼠對比，DIO小鼠腸黏膜中ZO-1的分布發(fā)生改變并伴隨著的表達量減少，導致跨上皮通透性增加。Karve等還評價了stx1和stx2a對腸道屏障功能的影響，發(fā)現(xiàn)腸道在暴露于這兩種毒素后，無論是在管腔內(nèi)還是在基底側(cè)隔室，均觀察到跨上皮通透性隨感染劑量和時間的增加而顯著增加。此外，還伴隨和等幾個關鍵緊密連接蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的基因表達量異常上調(diào)。然而，一些細菌卻對維護腸屏障完整具有積極作用，如是主要的丁酸鹽產(chǎn)生菌之一，其產(chǎn)生的丁酸鹽是腸上皮細胞的關鍵能量來源，可以通過促進黏蛋白合成、緊密連接重組以及和的上調(diào)來減輕局部炎癥和改善腸道屏障通透性，對II型糖尿病的治療具有積極作用。

腸屏障完整對維護腸道健康具有重要意義。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，緊密連接蛋白定位或表達的改變已成為診斷一些癌癥和炎癥性疾病的重要標志。特別是Claudin家族成員，如在克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和乳糜瀉中均能檢測到的表達增加，通過促進陽離子和水通過細胞旁途徑流入腸腔，從而引起腹瀉。Ishida等在高分化直腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)表達的增加，這證明的表達依賴于內(nèi)分泌腫瘤的起源部位。雖然Claudins的磷酸化是維持其功能所必需的，但異常的磷酸化會影響其定位和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而導致上皮屏障功能受損。在一項對直腸癌患者的研究中，過表達促進了腫瘤的形成。

3.2 維持上皮極性 細胞極性是指細胞表現(xiàn)出形態(tài)和分子的不對稱性，細胞的極性使其能夠?qū)︵徑毎蛢?nèi)環(huán)境的變化做出反應，在調(diào)節(jié)細胞遷移、增殖、分化等生理過程中起關鍵作用。在腸道中，腸上皮細胞有與內(nèi)環(huán)境接觸的頂膜，密封細胞旁間隙的側(cè)膜，以及錨定在細胞外基質(zhì)上的基底膜，故腸上皮細胞具有頂基底端極性（Apico-Basal Polarity，ABP）。其 中PAR（Par3/Par6/aPKC）和Crumbs（Crb/Pals1/PATJ）復合物在緊密連接的組裝過程中起關鍵作用。Bruurs等用W4細胞（一種腸道細胞極化的單細胞模型）驗證出需要通過小GTP酶Cdc42和其鳥嘌呤核苷酸交換因子Tuba的信號將頂膜限制在單個區(qū)域內(nèi)，使ABP發(fā)揮正常功能；而Par6A、Cdc42和GFTuba共定位在頂膜形成三聚體復合物，是腸細胞極化過程中形成單一頂端結(jié)構(gòu)域所必需的。此外，極性蛋白復合物還能與控制細胞間連接的緊密連接和黏附連接共同作用。如在果蠅上皮細胞ABP的建立中，或任意基因的缺失都能引起細胞極性的破壞，從而使相關緊密連接蛋白分布異常，影響緊密連接的正常功能。Otani等也在MDCK II細胞中證明敲除和會使細胞極性喪失，并且其通過與Claudin和JAM-A共同調(diào)節(jié)緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能。上皮細胞極性的建立對于屏障的形成和營養(yǎng)物質(zhì)的攝取及載體運輸至關重要，一些癌癥的發(fā)生（如結(jié)腸癌、乳腺癌和肝癌等）正是以上皮細胞極性喪失為重要標志。

4 緊密連接的調(diào)控通路

到目前為止，研究已經(jīng)證明了許多信號通路參與了緊密連接功能的調(diào)節(jié)，如蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A（PKA）、Rho/ROCK、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKt通路等。近年來，有關緊密連接調(diào)控的研究主要集中在Rho/ROCK信號通路及MAPK信號通路上。

4.1 Rho/ROCK信號通路 Rho是Ras超家族的成員，屬于小分子GTP結(jié)合蛋白，通過在GTP結(jié)合的活性構(gòu)象和非活性構(gòu)象之間的切換發(fā)揮GTP酶的作用，并被證明能夠廣泛調(diào)節(jié)腸上皮細胞功能。與其他GTP酶一樣，其與GDP的結(jié)合狀態(tài)主要受到GEF、GAP和GDI 3種類型分子的調(diào)控。它們在腸上皮細胞中高度表達，并能夠被細胞外的細菌、炎癥因子、生長因子等激活。RhoA是一種特性較好的RhoGTP酶，在靜息和炎癥條件下具有降低屏障滲透功能的作用。RhoA的下游效應分子是Rho相關的螺旋線圈狀激酶ROCK，ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員。它通過直接磷酸化MLC2或MYPT1引起pMLC的積累來誘導肌球蛋白收縮和緊密連接和黏附連接的解體。

在一些由促炎因子引起的腸道炎癥（如TNF-、IFN-、IL-1等）中能通過促進上皮緊密連接蛋白內(nèi)吞從而損害屏障功能，這一過程是由Rho-/ROCK-/MYPT-/MLC介導的肌動球蛋白環(huán)周收縮控制的。此外，在克羅恩病患者和TBNS誘導結(jié)腸炎的大鼠的發(fā)炎結(jié)腸黏膜中均能檢測到RhoA/ROCK活化增加。而一些細菌（如腸沙門氏菌和幽門螺桿菌）通過向上皮細胞注入自身蛋白來激活RhoA/ROCK信號，進而損害緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能。此外，內(nèi)毒素（一種由革蘭氏陰性細菌外膜形成的毒素）通過增加p115RhoGEF蛋白水平來激活RhoA，這也具有破壞上皮屏障的效果。

4.2 MAPK信號通路 MAPKs是一類高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，能夠響應多種細胞微刺激，特別是在炎癥信號轉(zhuǎn)導過程中起到激活轉(zhuǎn)錄因子和多種核蛋白、調(diào)控基因表達、細胞分化和凋亡的作用。MAPK信號通路通過一系列的磷酸化步驟被激活，首先是MAPK激酶的激活，其次是MAPK激酶磷酸化并激活MAPKs，主要包括絲裂原活化蛋白（p38）、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）等，它們共同參與細胞緊密連接屏障功能的調(diào)控。在人肺微血管內(nèi)皮細胞中，普通肝素通過抑制ERK1/2來降低內(nèi)皮屏障的高通透性并下調(diào)和的表達，從而保護緊密連接免受脂多糖誘導的損傷。在人真皮微血管內(nèi)皮細胞中，內(nèi)源性Src家族激酶的激活通過激活p38使內(nèi)皮屏障對低劑量的TNF-更敏感，從而導致內(nèi)皮細胞緊密連接的損傷。此外，髓過氧化物酶衍生的氧化劑能通過ERK1/2和JNK級聯(lián)途徑誘導血腦屏障功能障礙。

近年來，一些研究也證實了病原體刺激可以通過MAPK信號通路影響腸道緊密連接的變化。Wang等發(fā)現(xiàn)，豬圓環(huán)病毒II型感染豬氣管上皮細胞降低了和的表達水平，且激活了JNK/MAPK信號通路，影響了腸道的屏障功能。Zhao等比較了PEDV和傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）對緊密連接的損害作用，發(fā)現(xiàn)PEDV和TGEV感染都可以通過影響MAPK通路來下調(diào)部分緊密連接和黏附連接蛋白的表達，在感染早期即可損害IPEC-J2細胞的屏障完整性。Wang等發(fā)現(xiàn)，IL-17A和IL-17F通過上調(diào)緊密連接相關基因（包括）的表達，修復了HIV-1gp40導致的腸上皮屏障功能障礙，還發(fā)現(xiàn)NF-κB和MAPK通路參與了IL-17A和IL-17F介導的腸上皮屏障完整性修復。

5 展 望

緊密連接作為腸上皮細胞屏障的重要組成部分，對維持腸道的正常生理功能至關重要。緊密連接蛋白是許多致病細菌和病毒的靶標，它們通過劫持緊密連接蛋白的循環(huán)過程（內(nèi)化、水解、合成和釋放）進入細胞并感染細胞，或者通過信號通路機制使細胞間產(chǎn)生間隙。對腸道緊密連接進行更加深入地研究有助于更好地了解腸道疾病的作用機制，從而有效地防控腸道疾病。另外，緊密連接不僅存在于腸道中，還能在內(nèi)皮細胞中起到維護血管穩(wěn)態(tài)、血腦屏障完整的作用。自首個緊密連接蛋白Occludin被發(fā)現(xiàn)以來的幾十年間，有關于緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能的研究迅速發(fā)展，但對于緊密連接的研究仍處于初步階段，對于緊密連接與肌動蛋白細胞骨架、機械力、極性信號和膜脂協(xié)同調(diào)控上皮屏障功能和細胞極性的研究仍不成系統(tǒng)。隨著對緊密連接的研究不斷深入，將能夠構(gòu)建出完整的緊密連接結(jié)構(gòu)模型，更細致地了解緊密連接的作用機制，并為緊密連接引起的腸道疾病提供更好地防治方案。