杜偉立，尹美辰，楊理凱，張 濤，王 令，路宏朝

(陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000)

表達(dá)雞α干擾素重組釀酒酵母菌的構(gòu)建與鑒定

杜偉立，尹美辰，楊理凱，張 濤*，王 令，路宏朝

(陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000)

通過構(gòu)建雞α干擾素真核表達(dá)載體，以獲得能夠表達(dá)雞α干擾素的酵母工程菌株。首先根據(jù)GenBank公布的雞α干擾素基因序列設(shè)計(jì)上、下游引物，以略陽烏雞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增雞α干擾素基因片段。然后，利用基因重組技術(shù)將雞α-干擾素基因插入真核表達(dá)載體，通過菌落PCR和DNA測(cè)序確定目標(biāo)載體，構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)化至釀酒酵母AH109，再通過營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)、質(zhì)粒提取和PCR鑒定帶JMB440-ChIFN-α載體的重組酵母菌株。最終通過酵母培養(yǎng)、總蛋白收集、SDS-PAGE電泳和Western blot等，確定雞α干擾素基因能夠與酵母菌株重組，并表達(dá)α干擾素，蛋白條帶大小約為23 ku，與預(yù)期結(jié)果一致，表明成功構(gòu)建了表達(dá)雞干擾素基因的工程酵母菌株。

略陽烏雞；雞α-干擾素；真核表達(dá)載體；釀酒酵母

1957年Issaes A等[1]首先發(fā)現(xiàn)了病毒的干擾現(xiàn)象，即病毒感染后細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一種作用于其他細(xì)胞的物質(zhì)，從而干擾病毒的復(fù)制，于是將這種干擾病毒復(fù)制的因子稱為干擾素(interferon，IFN)。干擾素是一類具有高效廣譜抗病毒、調(diào)節(jié)免疫活性的蛋白質(zhì)因子，可以增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬活性以及淋巴細(xì)胞抗病毒活性等，是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分[2-4]。干擾素主要有Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型主要包括IFN-α和IFN-β，Ⅱ型的IFN-γ被稱為免疫干擾素。雖然干擾素最早發(fā)現(xiàn)于禽類，但其研究較人類和哺乳動(dòng)物相對(duì)滯后。1994年，Sekellick M J等[5]首次用原核表達(dá)載體成功表達(dá)了雞IFN-α基因，并對(duì)其結(jié)構(gòu)分析， 1995年Digby M R等[6]成功地克隆了雞IFN-γ基因，Sick C等[7]發(fā)現(xiàn)雞IFN-α抗病毒活性與其他種類的抗生素相比，有顯著的抗病毒能力。

目前，原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)雞α干擾素的方法已經(jīng)趨于成熟，但其活性受到宿主菌、表達(dá)載體、誘導(dǎo)表達(dá)條件及蛋白質(zhì)修飾等多種不確定因素的影響[8-12]。因此，研究和開發(fā)雞α干擾素的真核表達(dá)系統(tǒng)則是一種安全可靠的途徑。本研究以產(chǎn)于秦巴山區(qū)的具有強(qiáng)抗病性的地方品種略陽烏雞為研究材料，構(gòu)建高效表達(dá)雞α干擾素的釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)，以期獲得安全、高效雞IFN-α。本試驗(yàn)構(gòu)建的可表達(dá)雞α干擾素釀酒酵母可直接用于家禽的日常飼養(yǎng)管理，降低了家禽飼養(yǎng)管理的成本，可為家禽的安全生產(chǎn)提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

略陽烏雞，購自原產(chǎn)地陜西省漢中市略陽縣黑河壩；釀酒酵母、真核表達(dá)載體JMB440、大腸埃希菌Top10，本實(shí)驗(yàn)室保存；Ex-TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶HindⅢ、XhoI和SalI等酶，氨芐青霉素、顯色試劑、一抗(兔抗雞IFN-α多抗血清)、二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗)，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；PVDF膜、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒，BioFlux公司產(chǎn)品；基因序列測(cè)序、引物合成由北京奧科鼎盛生物有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù) GenBank所公布的雞IFN-α基因序列(EU334503.1)設(shè)計(jì)上、下游引物：ChINFF:上游引物5′ -cccaagcttccATGGACTACAAGGATGACGACGATAAAGCCTGCAACCACCTTCGC，含有HindⅢ酶切位點(diǎn)，下劃線為Flag標(biāo)簽；ChINF-R:gacgtcgac CTAAGTGCGCGTGTTGCCTG，含有SalI酶切位點(diǎn)。

1.2.2 真核表達(dá)載體與釀酒酵母工程菌的構(gòu)建 采用SDS堿裂解法提取略陽烏雞基因組DNA，經(jīng)PCR特異擴(kuò)增ChIFN-ɑ基因片段，其反應(yīng)體系(50 μL)：5μLTaq酶緩沖液，6 μL Mg2+，5 μL dNTP，引物各2 μL，模板1 μL，Taq酶0.3 μL，水28.7 μL；PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；53℃ 30 s,72℃ 1 min，34個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，12℃結(jié)束反應(yīng)。其片段純化后用HindⅢ和SalⅠ雙酶切、真核表達(dá)載體JMB440用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切并純化，通過T4連接酶于16℃過夜將ChIFN-ɑ基因插入JMB440載體。將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌Top10，用菌落PCR和測(cè)序鑒定重組JMB440-ChIFN-α載體。采用酵母一步轉(zhuǎn)化法將鑒定成功構(gòu)建的JMB440-ChIFN-α載體轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌株AH109，經(jīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷(缺亮氨酸SD培養(yǎng)基，Leu SD)篩選、提取其重組菌中質(zhì)粒作PCR鑒定能夠獲得可表達(dá)略陽烏雞干擾素α的重組菌株。

1.2.3 略陽烏雞ChIFN-α真核表達(dá)Western bot鑒定 挑取成功構(gòu)建的重組菌株AH109/JMB440-ChIFN-α單菌落于-Leu SD液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)。按照10 mL/L接種量分別接種到含5 mL Leu SD液體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)。將重組菌株收集，重懸于SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上樣緩沖液中，充分打散后沸水浴10 min破碎細(xì)胞后冰浴，然后于4℃、10 000 r/min離心10 min[11-14]。取蛋白上清液進(jìn)行120 g/L SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，洗脫后用封閉液封閉，加入一抗、洗脫,加二抗，然后用ECL曝光試劑曝光。

2 結(jié)果

2.1 略陽烏雞α干擾素基因片段PCR擴(kuò)增

本試驗(yàn)采用SDS法從略陽烏雞肝臟組織中提取基因組DNA(圖1)，并以其為模板經(jīng)PCR特異擴(kuò)增獲得一條大約為582 bp略陽烏雞α干擾素基因片段(圖2)，與預(yù)期的大小一致。

2.2 重組JMB440-IFN-α載體的鑒定

通過雙酶切雞α干擾素基因片段、酵母表達(dá)載體JMB440后用T4連接酶連接，并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌TOP10，挑9個(gè)單克隆，經(jīng)菌落PCR鑒定重組載體，獲得大約582 bp條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖3)。測(cè)序結(jié)果顯示，與NCBI公布的基因序列99.5%相同，表明目的基因已成功地克隆到載體中，命名為JMB440-ChIFN-α(圖4)。

2.3 重組釀酒酵母菌株與ChIFN-α基因表達(dá)鑒定

2.3.1 重組菌株的鑒定 將成功構(gòu)建的JMB440-ChIFN-α重組載體轉(zhuǎn)化至釀酒酵母AH109中后初步經(jīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型SD培養(yǎng)基篩選，然后挑取3個(gè)克隆搖菌提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR，結(jié)果出現(xiàn)約為582 bp大小的條帶(圖5)，從而證明成功構(gòu)建了表達(dá)雞α干擾素蛋白的釀酒酵母菌株。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～4.不同個(gè)體基因組

M.DNA Marker DL 2 000;1-4.Different individual genomes

圖1雞基因組DNA檢測(cè)

Fig.1 The chicken genome DNA testing

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～3.ChlFN-α基因擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000;1-3.ChlFN-α gene products

圖2 ChlFN-α擴(kuò)增

Fig.2 ChlFN-α amplification

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～9不同單克隆的菌落

M.DNA Marker DL 2 000;1-9.Different monoclonal colonies

圖3菌落PCR

Fig.3 Colony PCR

原載體是JMB440；aagctt是HindⅢ酶切位點(diǎn)；gtcgac是XhoⅠ酶切GACTACAAGGATGACGACGATAAA是Flag tag sequence

The original carrier is JMB440,aagctt isHind Ⅲ enzyme sites,gtcgac isXhoⅠenzyme GACTACAAGGATGACGACGATAAA is Flag tag sequence

圖4構(gòu)建JMB440-ChIFN-α

Fig.4 Constructeion of JMB440-ChIFN-α

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000;1～3.不同的單克隆提取的質(zhì)粒

M.DNA Marker DL 15 000;1-3.Different monoclonal extracted plasmids

圖5提取轉(zhuǎn)染后AH109質(zhì)粒PCR

Fig.5 PCR results of extraction of transfect AH109 plasmid

2.3.2 重組釀酒酵母菌株中ChIFN-α基因表達(dá)鑒定 初步鑒定成功釀酒酵母菌采用Western blot進(jìn)行鑒定ChIFH-α表達(dá)含量(圖6)，結(jié)果表明，所構(gòu)建雞α干擾素原核表達(dá)載體，其蛋白的分子質(zhì)量約為37 ku[15]，釀酒酵母表達(dá)的蛋白分子質(zhì)量約為23 ku。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了表達(dá)略陽烏雞α干擾素釀酒酵母重組菌株。

3 討論

1.原核表達(dá)載體Rossate-pET32a-ChIFN-α;2.釀酒酵母AH109空菌；3.釀酒酵母AH109-JMB440；4.釀酒酵母AH109-JMB440-ChIFN-α

1.Prokaryotic expression vector Rossate-pET32a-ChIFN-α;2.SaccharomycescerevisiaeAH109; 3.SaccharomycescerevisiaeAH109-JMB440；4.SaccharomycescerevisiaeAH109-JMB440-ChIFN-α

圖6 Western blot檢測(cè)

Fig.6 Western blot detection

家禽養(yǎng)殖過程易受病毒侵染，抗生素或其他藥物的過度使用不僅增加病毒對(duì)藥物的抵抗性，還能引起病毒突變?yōu)楦鞣N亞型，因此研究和開發(fā)新一代的抗病毒藥物是必然的需要[13-14]。直到研究者發(fā)現(xiàn)干擾素能夠抑制病毒自身核酸的復(fù)制而殺死病毒，這為治療禽類病毒性疾病帶來了希望。

雞IFN-α生產(chǎn)通常采用繁雜的生化工藝從動(dòng)物的組織中分離純化雞IFN-α?；诨蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展，通過簡(jiǎn)單、低成本的原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)外源基因的方法獲得雞IFN-α已經(jīng)成為發(fā)展趨勢(shì)，但在用原核表達(dá)載體pET-28a、pGEX-KG和pET-30a載體表達(dá)雞α干擾素基因時(shí)均沒有獲得表達(dá)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，切除編碼雞IFN-α基因序列的信號(hào)肽，構(gòu)建的雞IFN-α原核表達(dá)系統(tǒng)可獲得雞IFN-α，優(yōu)化發(fā)酵條件進(jìn)行后，可提高雞IFN-α的表達(dá)量。由于原核表達(dá)系統(tǒng)不能對(duì)外源蛋白進(jìn)行翻譯后修飾、折疊和分泌等問題，存在無法彌補(bǔ)的缺陷。真核表達(dá)系統(tǒng)可以彌補(bǔ)原核表達(dá)系統(tǒng)自身的缺陷，研究者通過構(gòu)建畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)，能夠獲得雞IFN-α，但是畢赤酵母中密碼子的偏好性比較強(qiáng)，外源基因表達(dá)較低，進(jìn)而很難獲得大量外源基因表達(dá)的多肽或蛋白[16-18]。本研究通過PCR擴(kuò)增雞α干擾素成熟肽基因片段，構(gòu)建雞IFN-α基因的真核表達(dá)載體JMB440-ChIFN-α，并且以釀酒酵母AH109為宿主菌，既能彌補(bǔ)原核表達(dá)系統(tǒng)不能修飾、折疊和分泌的缺陷，也能避免在畢赤酵母中表達(dá)時(shí)較高密碼子偏好性的障礙，實(shí)現(xiàn)雞IFN-α基因真核表達(dá)。另外，釀酒酵母容易保存，并能夠廣泛的使用在釀造、食品等工業(yè)，同時(shí)也是飼料的良好的添加劑，本研究構(gòu)建高效表達(dá)雞IFN-α基因的重組釀酒酵母菌株添加至飼料中直接飼喂，可降低生產(chǎn)成本，減少藥物使用，使雞等家禽免受病毒侵染，提高禽肉品質(zhì)。

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ConstructionandIdentificationofSaccharomycescerevisiaeExpressingChickenInterferonAlpha

DU Wei-li，YIN Mei-chen，YANG Li-kai，ZHANG Tao，WANG Ling，LU Hong-zhao

(SchoolofBiologicalScienceandEngineering,ShaanxiUniversityofTechnology,Hanzhong，Shaanxi,723000,China)

In this study,the eukaryotic expression vector was constructed,which the main purpose was to construct yeast strains efficient expression of chicken alpha interferon (ChIFN-α).Firstly,the primers were designed,according to the sequence of chicken interferon alpha gene published in GenBank.Total DNA of Lüeyang chicken as the template,ChIFN-α encoding mature chicken alpha interferon was amplified by PCR.Then,using the gene recombination technology,ChIFN-α gene was inserted into the eukaryotic expression vector.It proved that the recombinant plasmid was constructed successfully by colony PCR and DNA sequencing.Then JMB440-ChIFN-α was transformed into yeast strain AH109,which was detected by the auxotroph culture.Plasmid extraction and PCR identification were carried out to show ChIFN-α yeast strain harboring JMB440-ChIFN-α.Finally,ChIFN-α expression in AH109 was analyzed by SDS-PAGE and Western blot,which produced pattern of relative molecular weight band about 23 ku that it was consistented with the expected result.The results showed that engineering yeast strain expressing chicken interferon were obtained.

Lveyang black-bone chicken;chicken alpha interferon;eukaryotic expression vector;Saccharomycescerevisiae

2017-04-11

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-084)

杜偉立(1990-)，男，陜西周至人，碩士研究生，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。*

S852.43;Q789

:A

:1007-5038(2017)09-0028-04