周景明,賈 蕊,劉紅亮,祁艷華,聶守一,陳 冰,張改平,王愛萍

(鄭州大學生命科學學院，河南鄭州 450001)

豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的純化與鑒定

周景明,賈 蕊,劉紅亮,祁艷華,聶守一,陳 冰,張改平,王愛萍*

(鄭州大學生命科學學院，河南鄭州 450001)

為了獲得具有良好免疫原性的豬圓環(huán)病毒2型重組Cap蛋白，對pET-28a-ORF2-BL21重組菌種進行IPTG誘導表達，利用鎳親和層析法純化可溶性重組蛋白，并利用Western blot和ELISA鑒定其免疫反應性。結果表明，表達的重組蛋白分子質(zhì)量約為 26 ku，主要以可溶性蛋白的形式存在，純化后的蛋白純度可達到 90%以上，濃度為1.31 mg/mL，產(chǎn)量為30.6 mg/L菌液。Western blot和間接ELISA證實,重組蛋白能夠與PCV2陽性血清反應。結果表明，所制備的Cap蛋白具有較高的純度和較好的免疫反應性，有望用于PCV2抗體檢測免疫試紙的研制。

豬圓環(huán)病毒2型；核衣殼蛋白；蛋白純化；鑒定

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，20世紀90年代早期Allan G M等從患有PMWS的病豬體內(nèi)分離出PCV2。PCV2有3個主要的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，分別是ORF1(945個核苷酸，51-995位)，ORF2(702或705個核苷酸，位置是1734/1735-1030/1033/1034)和ORF3(315個核苷酸，671-357位)[1]。其中，ORF2編碼病毒的核衣殼蛋白，即Cap蛋白[2]。Cap蛋白由233個或234個氨基酸組成，分子質(zhì)量約為28 ku[3]。Cap蛋白是病毒的主要結構蛋白和主要的免疫原性蛋白，在病毒感染免疫反應中起著重要作用，包含病毒主要的抗原表位，具有良好的免疫原性，是刺激機體產(chǎn)生免疫應答的重要抗原，在流行病學診斷及疫苗學研究中起到關鍵作用[4-5]。因此，Cap蛋白是構建重組疫苗和臨床檢測的首選蛋白[6]，在PCV1和PCV2之間不存在抗原交叉反應[7]。為了獲取具有良好免疫反應性的PCV2重組Cap蛋白，本試驗利用原核表達系統(tǒng)表達并純化可溶性的重組Cap蛋白，并對純化的蛋白進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種pET28a-ORF2-BL21(DE3)和pET28a-BL21(DE3)，鄭州大學動物分子免疫實驗室保存；IPTG、卡那霉素和Bradford蛋白濃度測定試劑盒，Solarbio公司產(chǎn)品；HRP標記的羊抗豬酶標二抗，Abbkine公司產(chǎn)品；BeyoGoldTM His-tag Purification Resin，碧云天生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PCV2 Cap蛋白的誘導表達 將本實驗室保存的菌種pET28a-ORF2-BL21(DE3) 2 μL接種到含有10 μg/mL卡那霉素的經(jīng)過高壓滅菌的2 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min在搖床中培養(yǎng)過夜；次日取100 μL pET28a-ORF2-BL21菌液接種到含有10 μg/mL卡那霉素的經(jīng)過高壓滅菌的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)約1.5 h，測菌液OD值，當OD值在0.6～0.8之間，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃、220 r/min誘導表達過夜。同時用pET28a-BL21(DE3)作陰性對照。通過SDS-PAGE凝膠電泳鑒定重組Cap蛋白表達情況。

1.2.2 PCV2 Cap蛋白的可溶性分析 將100 mL誘導表達后的菌液轉移到離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，棄上清，加10 mL非變性裂解緩沖液重懸菌液，用超聲破碎儀破碎菌體，設定超聲破碎的工作時間為10 min，超聲3 s，間歇3 s，總工作時間為5 min，超聲過程中要將離心管置于冰水混合物中。超聲結束后，取1 mL破碎后的菌液，12 000 r/min離心2 min，收集上清，并用1 mL PBS重懸沉淀，各取20 μL上清和重懸的沉淀進行SDS-PAGE凝膠電泳，分析蛋白的可溶性。

1.2.3 PCV2 Cap蛋白的純化 超聲破碎后的菌液上清用鎳親和層析法純化重組Cap蛋白。取1 mL層析介質(zhì)裝柱，用2倍體積的平衡緩沖液平衡層析介質(zhì)3次。將超聲破碎后的菌液4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清過濾后上柱，流速控制為0.5 mL/min，收集流出液以待后續(xù)分析；用2倍柱體積的洗滌緩沖液(2 mmol/L imidazole,50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl)洗滌柱子5次，以去除雜蛋白；用2倍柱體積的洗脫緩沖液(50 mmol/L imidazole,50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl)以0.5 mL/min的流速洗脫10 次，將洗脫液收集到不同的離心管中，立即將收集的蛋白梯度透析。透析結束后，取200 μL透析后的蛋白樣品，以備后續(xù)鑒定用。

1.2.4 重組PCV2 Cap蛋白鑒定

1.2.4.1 SDS-PAGE與Western blot鑒定 純化的Cap蛋白進行SDS-PAGE電泳；用轉膜儀將蛋白條帶轉至NC膜上；轉膜完畢后，將NC膜置于50 mL/L脫脂奶中封閉，過夜；次日取出NC膜，PBST洗滌3次，加入PCV2陽性血清(1∶100稀釋)，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，加入HRP標記羊抗豬IgG(1∶1 000稀釋)，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，用化學發(fā)光顯色，觀察結果。

1.2.4.2 Cap蛋白濃度測定 用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定透析后的蛋白濃度。采用微孔酶標儀法，取完全溶解蛋白標準品10 μL，用9 g/L NaCl或PBS稀釋標準品稀釋至250 μL，使終濃度為0.2 mg/mL。5×G250染色液使用前請顛倒3次～5次混勻，取1 mL 5×G250染色液，加入4 mL雙蒸水，混勻成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存1周。將稀釋后的標準品分別取0、2、4、6、8、12、16、20 μL加到96孔板中，加PBS稀釋液補足到20 μL。將樣品作適當稀釋，取20 μL到96孔板的樣品孔中(表1)。各孔加入200 μL稀釋后的1×G250染色液，室溫放置5 min。用酶標儀測定OD 570 nm的吸光度。根據(jù)標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度。

1.2.4.3 間接ELISA法測定Cap蛋白免疫反應性 向酶標板中每孔加入100 μL 3 μg/mL純化的重組Cap蛋白，包被過夜；次日棄去包被液，用PBST洗滌3次，加50 g/L脫脂奶37℃孵育1 h；棄去封閉液，用PBST洗滌3次，加入倍比稀釋(1∶500～1∶128 000)的PCV2陽性血清，同時設PCV2陰性血清對照，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，加入1∶1 000稀釋的HRP標記的羊抗豬IgG，顯色試劑顯色后用酶標儀測OD 450 nm值，分析純化蛋白與標準PCV2陽性血清的免疫反應性。

表1 蛋白濃度測定加樣量

2 結果

2.1 PCV2 Cap蛋白的誘導表達

重組菌株pET28a-ORF2-BL21(DE3)和對照菌株pET28a-BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導后，進行SDS-PAGE凝膠電泳分析Cap蛋白的表達情況，結果顯示(圖1)，與pET28a-BL21(DE3)相比，pET28a-ORF2-BL21(DE3)在26 ku附近有1條明顯的表達條帶，與預測的Cap蛋白分子質(zhì)量大小相符合。

2.2 重組Cap蛋白的可溶性分析

重組菌株pET28a-ORF2-BL21(DE3)在30℃誘導過夜，超聲破碎后取上清和沉淀上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，pET28a-BL21(DE3)作陰性對照，結果顯示(圖2)，Cap蛋白主要存在于超聲破碎后的上清中，以可溶性蛋白的形式存在。

2.3 重組Cap蛋白的純化

用鎳親和層析法純化蛋白，SDS-PAGE電泳的結果顯示(圖3),在用含有50 mmol/L與250 mmol/L咪唑的洗脫液中均發(fā)現(xiàn)純度達到90%以上的重組Cap蛋白。

2.4 Cap蛋白Western blot鑒定

對純化后的蛋白進行Western blot分析，用PCV2標準陽性血清做一抗，HRP標記的羊抗豬IgG做酶標二抗，結果表明(圖4)，大約在26 ku處的目的蛋白條帶顯色，用PCV2陰性血清做一抗的陰性對照不顯色，說明PCV2重組Cap蛋白能與PCV2標準陽性血清特異性的結合，具有良好的免疫反應性。

M.蛋白分子質(zhì)量標準;1.IPTG誘導表達過夜后的pET28a-BL21(DE3)；2.IPTG誘導表達過夜后的pET28a-ORF2-BL21(DE3)

M.Protein molecular weight Marker;1.pET28a-BL21(DE3) inducted with IPTG for overnight；2.pET28a-ORF2-BL21(DE3) inducted with IPTG for overnight

圖1重組Cap蛋白的表達鑒定

Fig.1 Identification of the expression of recombined Cap protein

M.蛋白分子質(zhì)量標準;1.誘導表達后的pET28a-BL21(DE3)；2.誘導表達后的pET28a-ORF2-BL21超聲破碎后上清；3.誘導表達后的pET28a-ORF2-BL21超聲破碎后沉淀

M.Protein molecular weight Marker;1.pET28a-BL21(DE3) inducted with IPTG；2.Supernatant of pET28a-ORF2-BL21 after ultrasonic breaking；3.Precipitation of pET28a-ORF2-BL21 after ultrasonic breaking

圖2 Cap蛋白的可溶性分析

Fig.2 Solubility analysis of recombined Cap protein

M.蛋白分子質(zhì)量標準;1、7.穿流液；2、3.含10 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫下的雜蛋白；4、5.含50 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫下的目的蛋白；6.含250 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫下的目的蛋白；8.純化后的柱子

M.Protein molecular weight Marker;1,7.Overflow liquid；2,3.Impurity protein by washing buffer with 10 mmol/L imidazole；4,5.Purified protein by washing buffer with 50 mmol/L imidazole；6.Purified protein by washing buffer with 250 mmol/L imidazole；8.Stuffing of purified Ni-NTA

圖3重組蛋白Cap的SDS-PAGE鑒定結果

Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombined Cap protein

M.蛋白分子質(zhì)量標準;1.PCV2陽性血清做一抗；2.陰性對照(PCV2陰性血清做一抗)

M.Protein molecular weight Marker;1.Immunoblotting reaction using swine positive serum against PCV2；2.Immunoblotting reaction using swine negetive serum against PCV2

圖4純化的Cap蛋白Western blot鑒定結果

Fig.4 Western blot analysis of recombined Cap protein by anti-PCV2 antibodies

2.5 重組Cap蛋白濃度測定

根據(jù)Bradford蛋白濃度測定試劑盒的說明書進行操作，酶標儀讀數(shù)見表2，其中1號～8號是稀釋后的BSA標準品不同濃度的OD 570 nm吸光光度值，9號～12號是不同濃度的重組Cap蛋白的OD 570 nm吸光光度值，根據(jù)1號～8號的數(shù)值和對應的稀釋后標準品的蛋白濃度得到標準曲線(圖5)方程為：

y=0.084x+0.688；R2=0.998。

當 R2>0.97 時測量結果準確可信，因此將待測樣品的OD值代入標準方程并求平均值得到純化的重組Cap蛋白的濃度為1.31 mg/mL，產(chǎn)量為30.6 mg/L菌液。

表2 蛋白濃度測定OD 570 nm值

圖5 重組蛋白濃度的標準曲線

2.6 重組Cap蛋白免疫反應性鑒定

采用間接ELISA測定PCV2標準陽性血清抗體效價，當血清1∶4 000稀釋時，陽性值為0.257，陰性值為0.122，此時陽性值是陰性值的2.1倍，因此Cap蛋白與PCV2陽性血清反應效價能達到1∶4 000。隨著稀釋度的增加，標準陽性血清的OD 570 nm值呈下降的趨勢(圖6)，而陰性血清的OD 570 nm值基本保持不變。

圖6 純化蛋白的ELISA檢測

3 討論

PCV2是環(huán)狀單鏈的DNA病毒，能夠引起斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，患病仔豬表現(xiàn)為生長遲緩、體重降低和死亡[8]。PCV2 ORF2編碼的Cap蛋白是PCV2的結構蛋白，能夠刺激機體產(chǎn)生特異性的中和抗體[9-10]。Cap蛋白含有高度保守的抗原表位，可以誘導PCV2陽性動物產(chǎn)生超強免疫應答，因此Cap蛋白可以作為疫苗研制和PCV2診斷技術的抗原[10-11]。目前，Cap蛋白的表達系統(tǒng)有細菌表達系統(tǒng)[9-10]、桿狀病毒表達系統(tǒng)[11-12]、粉紋夜蛾表達系統(tǒng)[13]、活載體表達系統(tǒng)[14]等。大腸埃希菌表達系統(tǒng)是最常用的細菌表達系統(tǒng)，具有遺傳背景清楚、生長迅速、培養(yǎng)簡單、重組子穩(wěn)定等特點[15]。本研究采用大腸埃希菌表達系統(tǒng)，表達并純化得到的重組Cap蛋白分子質(zhì)量約為26 ku，并以可溶性蛋白的形式存在，用鎳親和層析法純化重組Cap蛋白，純度可達到90%以上，純化得到的產(chǎn)量為30.6 mg/L菌液。Western blot證實，重組蛋白與PCV2陽性血清反應。通過間接ELISA測定重組Cap蛋白與PCV2陽性血清反應效價能達到1∶4 000，表明該蛋白有良好的免疫反應性，本研究可為免疫膠體金抗體檢測試紙的研制提供抗原。

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PurificationandIdentificationofRecombinantPorcineCircovirusType2CapsidProtein

ZHOU Jing-ming,JIA Rui,LIU Hong-liang,QI Yan-hua,NIE Shou-yi,CHEN Bing,ZHANG Gai-ping,WANG Ai-ping

(SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan,450001,China)

To obtain the immunogenic PCV2 Cap protein,recombinant bacteria pET-28a-ORF2-BL21 was induced with IPTG,the soluble recombinant protein were purified with Ni-affinity chromatography column,then the immunoreactivity of the purified recombinant capsid protein was identified by Western blot and indirect ELISA.The result showed that soluble recombinant protein with molecular weight of about 26 ku was expressed in recombinant bacteria pET-28a-ORF2-BL21 after induced with IPTG.The purity of purified Cap protein was above 90 % and the concentration was 1.31 mg/mL.The yield of protein was 30.6 mg per liter bacteria liquid.Western blot and indirect ELISA showed that the purified protein could react with the PCV2 positive serum.The recombinant Cap protein prepared in this study has high purity and strong immunoreactivity,which has the potential to be used for the development of colloidal gold immunochromatographic strip for detection of PCV2 antibody．

PCV2;Cap protein;purification;identification

2017-01-23

國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0500704)；鄭州市科技創(chuàng)新團隊項目(131PCXTD622)

周景明(1972-)，男，河南新野人，副教授，博士，從事分子免疫學與免疫學檢測技術研究。*

S852.659.2;Q789

:A

:1007-5038(2017)09-0023-05