唐夢君，周 倩，張小燕，張 靜，陳大偉，顧 榮，萬 玉，楊星星，趙 敏，周 生，高玉時

(中國農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所/農(nóng)業(yè)部禽類產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(揚州)，江蘇揚州 225125)

雞源結(jié)腸彎曲菌耐藥性分析

唐夢君，周 倩，張小燕，張 靜，陳大偉，顧 榮，萬 玉，楊星星，趙 敏，周 生，高玉時*

(中國農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所/農(nóng)業(yè)部禽類產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(揚州)，江蘇揚州 225125)

為了解江蘇省雞源結(jié)腸彎曲菌的流行情況和藥物敏感性，對江蘇省不同規(guī)?；B(yǎng)雞場、農(nóng)貿(mào)市場和超市的雞泄殖腔樣品和雞肉產(chǎn)品進行結(jié)腸彎曲菌的分離及PCR鑒定；采用紙片擴散法測定分離株對17種抗菌藥物的敏感性。結(jié)果顯示，從750份樣品(禽肉產(chǎn)品和泄殖腔棉拭子)中分離到81株結(jié)腸彎曲菌，分離率為10.8%。耐藥性試驗結(jié)果顯示，80%以上菌株對頭孢曲松、妥布霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素和甲氧芐氨嘧啶耐藥，其中甲氧芐氨嘧啶耐藥率達99%，對美羅培南和氟苯尼考保持高度敏感。所有測試菌株出現(xiàn)多重耐藥，優(yōu)勢耐藥譜為LIN/CRO/CN/T/NOR/CIP。調(diào)查結(jié)果為結(jié)腸彎曲菌防控提供參考依據(jù)。

雞；結(jié)腸彎曲菌；耐藥性；耐藥譜

結(jié)腸彎曲菌(Campylobactercoli)是彎曲菌屬的一種，是近十幾年來受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注的人畜共患病原菌，可引起人類腸炎和食物中毒，其主要癥狀為腹瀉性腸炎[1]。結(jié)腸彎曲菌易定植于家禽腸道，感染后無明顯癥狀，臨床上不需要抗菌藥物的治療，但雞群長期攜帶此菌，在預防和控制其他家禽疾病的過程中，大量抗菌藥物的使用導致了彎曲菌耐藥菌株的產(chǎn)生[2-3]。當人類感染了具有耐藥性的彎曲菌時，將嚴重影響臨床治療的有效性。因此，以江蘇省分離菌株為基礎，了解結(jié)腸彎曲菌的污染情況，并掌握該菌對常用抗菌藥物的耐藥程度及不同菌株所表現(xiàn)出的耐藥譜的差異，填補我國結(jié)腸彎曲菌流行病學資料，為我國耐藥結(jié)腸彎曲菌的監(jiān)測及有效防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源及菌株 采集江蘇省徐州、宿遷和鹽城等各市縣不同規(guī)模化養(yǎng)雞場、農(nóng)貿(mào)市場和超市的雞泄殖腔樣品和雞肉樣共750份。泄殖腔棉拭子樣品用滅菌棉簽采集雞泄殖腔，插入Carry-Blair運輸培養(yǎng)基；雞肉樣品用經(jīng)PBS浸泡過的滅菌棉球擦拭。質(zhì)控菌株大腸埃希菌(Escherichiacoli)ATCC25922，揚州大學獸醫(yī)學院惠贈。

1.1.2 引物 采用彎曲菌屬的16 S rRNA基因以及結(jié)腸彎曲菌ceuE基因為靶基因。引物序列參照文獻[4]。16 S rRNA基因，上游引物5′-ATCTAATGGCTTAACCATTAAAC-3′，下游引物： 5′-GGACGGTAACTAGTTTAGTATT-3′；結(jié)腸彎曲菌ceuE基因，上游引物：5′-AATTGAAAAATTGCTCCAACTATG-3′，下游引物：5′-TGATTTTATTATTTGTAGCAGCG-3′，引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑 Cary-Blair半固體培養(yǎng)基、CCDA培養(yǎng)基、含200 mL/L脫纖維綿羊血MH培養(yǎng)基、含200 mL/L甘油BHI培養(yǎng)基；PBS溶液；rTaqpremix；細菌DNA提取試劑盒；其他均為試驗常規(guī)試劑。

1.1.4 抗菌藥物 選取8大類17種畜禽養(yǎng)殖常用抗菌藥物，包括β-內(nèi)酰胺類有氨芐西林(AMP)、頭孢曲松鈉(CRO)、亞胺培南(IPM)、美羅培南(MEM)；氨基糖苷類有慶大霉素(CN)、阿米卡星(AK)、妥布霉素(TOB)；喹諾酮類有諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)、氧氟沙星(LEV)；磺胺類有復方新諾明(SXT)、甲氧芐氨嘧啶(T)；大環(huán)內(nèi)酯類有紅霉素(E)、阿奇霉素(AZM)；四環(huán)素類有四環(huán)素(TE)；潔霉素類有林可霉素(LIN)；氯霉素類有氟苯尼考(FF)。以上抗菌藥物為英國OXOID公司產(chǎn)品。

1.1.5 主要儀器 生物安全柜(A2)，日本ESCO公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱(HPS-150)，太倉市華美生化儀器廠產(chǎn)品；PCR儀，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-12型)，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，GBOX基因有限公司產(chǎn)品；水浴鍋(XMTD-204)，金壇市文化儀器有限公司產(chǎn)品；離心機(XT15R)，日本HITACHI公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離 從運送培養(yǎng)基中取出棉拭，置于含1 mL滅菌 PBS的指形管中，充分浸透，取100 μL浸出液經(jīng)適當稀釋后，取100 μL涂布CCDA平板；雞肉樣品取100 μL 滅菌棉球擠出的PBS液，經(jīng)稀釋后取100 μL涂布CCDA平板，微需氧條件42℃培養(yǎng)36 h。挑取CCDA平板上灰白色的可疑菌落，進行PCR鑒定。

1.2.2 二重PCR鑒定 經(jīng)純化后的結(jié)腸彎曲菌采用試劑盒提取細菌基因組DNA。采用二重PCR鑒定結(jié)腸彎曲菌，25 μL PCR反應體系：rTaqpremix 12.5 μL，上、下游引物兩對(10 μmol/L)各1 μL，無菌去離子水9.5 μL，模板DNA 1 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預變性1 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；再72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳成像。

1.2.3 藥敏試驗 采用WHO推薦的Kirby-Bauer法，根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)[5]標準方法進行。用無菌棉簽從M-H平板上刮取純化培養(yǎng)的細菌至500 μL PBS緩沖溶液，將菌液稀釋至0.5麥氏濃度，取100 μL稀釋后的菌液均勻涂布于M-H平板，根據(jù)藥敏紙片說明書進行測試，42℃微需氧培養(yǎng)36 h～48 h后,用直尺測定抑菌圈直徑(mm)。以抑菌圈直徑大小判斷耐藥(resistant)、中敏(intermediate)和敏感(susceptible)。數(shù)據(jù)采用Excel2015整理分析。

2 結(jié)果

2.1 分離鑒定結(jié)果

結(jié)腸彎曲菌在CCDA平板上為灰白色濕潤的菌落(圖1)，挑取可疑菌落經(jīng)PCR鑒定，能成功擴增出兩條大小為857 bp和462 bp的目的片段(圖2)。對采集的750份樣品進行統(tǒng)計，得到結(jié)腸彎曲菌81株，分離率為10.8%。其中，泄殖腔樣品600份，分離率為9.5%，分離到57株結(jié)腸彎曲菌；禽肉產(chǎn)品150份，分離率為16%，分離到24株結(jié)腸彎曲菌。

圖1 細菌的菌落形態(tài)

2.2 耐藥性分析

2.2.1 細菌對17種抗菌藥物耐藥情況 81株雞源結(jié)腸彎曲菌分離菌株對17種抗菌藥物存在不同程度的耐藥，大多數(shù)菌株對氨芐西林、頭孢曲松鈉、慶大霉素、妥布霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復方新諾明、甲氧芐氨嘧啶、四環(huán)素和林可霉素耐藥。對甲氧芐氨嘧啶耐藥率最高，達99%，對美羅培南和氟苯尼考最為敏感，敏感率為98%和91%。對氨芐西林、阿奇霉素、四環(huán)素和氧氟沙星保持中度敏感(表1)。

M.DNA 標準DL 2 000;1～23.樣品

M.DNA Marker DL 2 000;1-23.Samples

圖2 PCR鑒定結(jié)果

Fig.2 PCR identification results

表1 81株雞源結(jié)腸彎曲菌抗菌藥物敏感性檢測結(jié)果

2.2.2 分離菌株對17種抗菌藥物的耐藥譜分析 81株結(jié)腸彎曲菌對17種抗菌藥物共產(chǎn)生12種耐藥類型，30種耐藥譜型。1株結(jié)腸彎曲菌對15種抗菌藥物有不同程度耐藥，存在明顯多重耐藥現(xiàn)象，所有菌株至少耐4種抗菌藥物。耐9種抗菌藥物的菌株數(shù)量最多有13株，占16.0%，優(yōu)勢耐藥圖譜為LIN/CRO/CN/T/NOR/CIP(表2)。

表2 雞源結(jié)腸彎曲菌的耐藥譜型

3 討論

從江蘇省采集的750份雞泄殖腔和雞肉樣品中分離到81株結(jié)腸彎曲菌，分離率為10.8%。結(jié)腸彎曲菌分離株對頭孢曲松、妥布霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素、甲氧芐氨嘧啶耐藥率較高，這與近年來我國大量使用喹諾酮類等抗菌藥物治療家禽腹瀉等疾病有關(guān)[6]。這與王新等[7]的報道一致，但與韓新鋒等[6]報道的四環(huán)素耐藥率為91.67%差異較大，原因可能是不同地區(qū)在畜禽養(yǎng)殖過程中抗菌藥物的選擇和用量標準不同，從而導致耐藥性差異。分離株對氟苯尼考保持高度敏感性，可考慮作為臨床換用藥物。已有研究表明，在彎曲菌感染中，結(jié)腸彎曲菌少于空腸彎曲菌，僅占5%[7]，但來自禽肉和其他動物肉的結(jié)腸彎曲菌多重耐藥比空腸彎曲菌更為普遍[8-10]。17種抗菌藥物的藥敏檢測結(jié)果表明，所有菌株耐4種抗菌藥物以上的達100%，最多可耐15種抗菌藥物，說明雞源結(jié)腸彎曲菌多重耐藥普遍，應該指導畜禽生產(chǎn)上抗菌藥物的合理使用，最大程度上避免抗菌藥物的濫用。同時，應該建立長期的彎曲菌耐藥性監(jiān)測，了解其變化趨勢，為彎曲菌病的防控提供依據(jù)。

[1] Scallan E,Hoekstra R M,Mahon B E,et al.An assessment of the human health impact of seven leading foodborne pathogens in the United States using disability adjusted life years[J].Epidemiol Infect,2015,143:2795-2804.

[2] Gripp E,Hlahla D,Didelot X,et al.Closely relatedCampylobacterjejunistrains from different sources reveal a generalist rather than a specialist lifestyle[J].BMC Genomics,2011,12:584.

[3] Rasschaert G,Houf K,Van Hende J,et al.Campylobacter contamination during poultry slaughter in Belgium[J].J Food Prot,2006,69(1):27-33.

[4] 何 蕊,黃金林,許海燕,等.彎曲菌多重PCR檢測方法的建立及其初步應用[J].揚州大學學報:農(nóng)業(yè)與生命科學版,2007,28(1):5-8.

[5] Clinical and Laboratory Standards Instiute.Mwthods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically[S].NCCLS,2015.

[6] 韓新鋒,劉書亮,陳 荀,等.雞肉生產(chǎn)鏈空腸彎曲桿菌耐藥性研究[J].中國人獸共患病學報,2013,29(2):199-204.

[7] 王 新,周 婷,孟江洪.禽源結(jié)腸彎曲桿菌的耐藥性分析與MLST分型[J].畜牧獸醫(yī)學報,2010,41(2):234-239.

[8] Arestrup F M,NielsenI E M,Madsen M,et al.Antimicrobial susceptibility patterns of thermophilicCampylobacterspp.from humans,pigs,cattle,and broilers in Denmark[J].Antimicrob Agents Chemother,997,41:2244-2250.

[9] Luangtongkum T,Morishita T Y,Isona J,et al.Effect of conventional and organic production practices on the prevalence and antimicrobial resistance ofCampylobacterspp.in poultry[J].Appl Environ Microbiol,2006,72:3600-3607.

[10] Ge B,White D G,Mcdermott P F,et al.Antimicrobial-resistantCampylobacterspecies from retail raw meats[J].Appl Environ Microbiol,2003,69:3005-3007.

AntimicrobialResistanceofCampylobactercoliIsolatedfromChickens

TANG Meng-jun,ZHOU Qian,ZHANG Xiao-yan,ZHANG Jing,CHEN Da-wei,GU Rong,WAN Yu,YANG Xing-xing,ZHAO Min,ZHOU Sheng,GAO Yu-shi

(PoultryInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,LaboratoryofQualityandSafetyRiskAssessmentforPoultryMinistryofAgriculture(Yangzhou),Yangzhou,Jiangsu,225125,China)

The aim of the research was to study the epidemiology and antimicrobial resistance ofCampylobactercoliisolated from chickens in Jiangsu province.81 strains were isolated and idetified by polymerase chain reaction from 750 samples which collected from chicken meat and cloacal swabs in different chicken farms,agricultural markets and supermarkets.81 isolates were examined for antimicrobial resistance by using K-B method.The results showed that more than 80% strains performed resistance to ceftriaxone,tobramycin,norfloxacin,ciprofloxacin,lincomycin and trimethoprim,the resistant rate of trimethoprim was 99%,all strains kept susceptible to meropenem and florfenicol.A total of 81 strains were multi-drug resistance,the advantage resistant profile was LIN/CRO/CN/T/NOR/CIP.The research provided evidence for surveillance of the antimicrobial resistance ofC.coli.

chicken;Campylobactercoli;antimicrobial resistance;resistant profile

2017-01-05

十三五國家重點研發(fā)計劃高危金屬中毒病防控技術(shù)研究項目(2016YFD0501208)；2017國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估重大專項項目(GJFP2017007); 揚州市社會發(fā)展項目(yz2016058);揚州市家禽質(zhì)量安全科技服務平臺建設項目(yz2015162)

唐夢君(1980-)，女,重慶人，博士，主要從事食源性病原菌檢測及耐藥性研究。*

S859.796

:A

:1007-5038(2017)09-0018-05