徐進(jìn)強(qiáng)，梁紅雁，趙吳靜，武中庸，陳 鑫，李昱輝,蒲萬霞*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

一株馴化啤酒酵母的分離鑒定及擴(kuò)大培養(yǎng)條件的優(yōu)化

徐進(jìn)強(qiáng)1,2，梁紅雁1,2，趙吳靜1，武中庸1，陳 鑫1,2，李昱輝1,2,蒲萬霞1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

為篩選一株馴化啤酒酵母,并對發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化，為今后大規(guī)模生產(chǎn)提供試驗數(shù)據(jù)。于麥芽汁培養(yǎng)基分離挑選某株具有較好生長力的酵母菌，進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生化及分子生物學(xué)鑒定。應(yīng)用正交試驗設(shè)計，從搖瓶溫度、pH、取樣時間及發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量等方面進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，馴化酵母菌株形態(tài)學(xué)、生化鑒定證明該菌株屬于酵母屬；發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)最佳工藝為：轉(zhuǎn)速200 r/min，接種量50 mL/L，裝液量4.5 L，此條件下酵母活菌含量為2.8×108CFU/mL。馴化前后表現(xiàn)一致，沒有發(fā)生變異。優(yōu)化啤酒酵母菌的發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)工藝，為下一步規(guī)?；a(chǎn)提供理論參考。

馴化酵母;生化鑒定；分子鑒定；發(fā)酵罐；擴(kuò)大培養(yǎng)

啤酒酵母因其發(fā)酵性能良好、繁殖力強(qiáng)、性能穩(wěn)定等特點而成為目前應(yīng)用最廣泛的單細(xì)胞真菌微生物之一[1]，人類利用酵母制作發(fā)酵產(chǎn)品的歷史可以追溯到公元前3 000多年[2]。酵母發(fā)酵是指細(xì)胞將有機(jī)物氧化釋放的電子直接交給底物，釋放能量并產(chǎn)生各種不同代謝產(chǎn)物，以有機(jī)物為最終電子受體的生物氧化過程，是其獲得能量的途徑[3]。

目前，發(fā)酵一般分為搖瓶發(fā)酵和擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵。實驗室條件下，得到搖瓶優(yōu)化條件后再進(jìn)行發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)[4]。但因發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)過程較復(fù)雜，常存在“放大效應(yīng)”，即在實驗室搖瓶研究中得到的數(shù)據(jù)和規(guī)律，在放大過程中，隨著發(fā)酵規(guī)模的擴(kuò)大，因為發(fā)酵罐溶解氧、二氧化碳含量、剪切力等影響因素[5-6]，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量不斷下降，無法重復(fù)實驗室的試驗結(jié)果。因此，篩選一株高性能酵母及對發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化，對于提高工業(yè)生產(chǎn)效率具有重要意義。本試驗旨在研究篩選一株馴化啤酒酵母及對發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為今后大規(guī)模生產(chǎn)提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 馴化酵母菌，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所天然獸藥研發(fā)試驗室保存,實驗室保存原始酵母菌株。

1.1.2 主要試劑和儀器設(shè)備 培養(yǎng)基主要成分麥芽汁，購自甘肅蘭州黃河啤酒廠；蛋白胨，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

微量生化鑒定管，電子比濁儀Densi CHEK Plus，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，PCR儀，電泳槽，微生物發(fā)酵罐。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離與鑒定

1.2.1.1 酵母菌分離 采用涂布平板法對酵母菌進(jìn)行分離。

1.2.1.2 酵母菌鑒定 進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化 挑取斜面酵母保存菌株，置于20 mL已高壓滅菌的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，于25℃、110 r/min條件下培養(yǎng)40 h，制成種子液備用。取1 mL種子液于100 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基中，于25℃、110 rmin條件下培養(yǎng)40 h，備用。利用L9(33)正交試驗設(shè)計的方法，從溫度、pH及取樣時間對酵母搖瓶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，為發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)工藝研究奠定基礎(chǔ)(表1)。

表1 正交試驗因素設(shè)計

1.2.3 發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)工藝研究 菌種經(jīng)過種子液和搖瓶的初步逐級擴(kuò)大培養(yǎng)后，接著進(jìn)行10 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)條件優(yōu)化研究，在擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，經(jīng)過靜息期、對數(shù)生長期、飽和期、死亡期等階段。在靜息期期間，將發(fā)酵罐轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速調(diào)至50 r/min～100 r/min，緩慢轉(zhuǎn)動4 h～5 h后，再慢慢調(diào)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速至試驗值，這樣既可使菌適應(yīng)新環(huán)境，充分的與麥芽汁培養(yǎng)基混合，同時，也可以避免剪切力過大造成的酵母菌死亡。采用正交試驗設(shè)計[7]，從轉(zhuǎn)速、接種量和裝液量方面進(jìn)行優(yōu)化(表2)。具體操作步驟如下：首先挑取斜面保存酵母菌株制備種子液20 mL，將此種子液以10 mL/L接種量接入250 mL的搖瓶中，發(fā)酵液備用。將發(fā)酵罐清洗干凈后，罐內(nèi)不裝任何液體，121℃蒸汽滅菌 20 min[8]，待冷卻后，向罐中加入液體培養(yǎng)基，安裝校準(zhǔn)過的pH及DO電極，與罐體一起115℃滅菌20 min～25 min，待罐中培養(yǎng)基溫度冷卻至20℃時，在發(fā)酵罐火焰圈的保護(hù)下，無菌接種種子液，慢慢調(diào)整轉(zhuǎn)子，加大至試驗設(shè)計轉(zhuǎn)速，再通過操作控制其各個關(guān)鍵因素(接種量、轉(zhuǎn)速、裝液量、溫度、pH及時間等)進(jìn)行發(fā)酵[9]；每24 h取樣1次，用生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋，利用血細(xì)胞計數(shù)法測定其菌濃度，直至發(fā)酵結(jié)束。

表2 正交試驗因素設(shè)計

2 結(jié)果

2.1 酵母的分離鑒定結(jié)果

在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上酵母菌為乳白色,圓形，邊緣整齊，有光澤，平坦的菌落；顯微鏡觀察時，菌株細(xì)胞多呈橢圓形或長卵形，細(xì)胞為芽殖，不形成菌絲，無擲孢子和子囊子孢子。

2.1.1 酵母的生理生化鑒定結(jié)果 結(jié)果表明，該菌可發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖和棉子糖，不能發(fā)酵乳糖、木糖、纖維二糖和海藻糖；在碳同化試驗中，可同化葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖和甘露糖，不同化纖維二糖、D-木糖、密二糖、海藻糖和L-阿拉伯糖；在氮同化試驗中，可同化(NH4)2SO4，不同化KNO3；醇類同化試驗中，可同化乙醇，不同化山梨醇。以上特征符合釀酒酵母的特性，歸屬為釀酒酵母屬。

2.1.2 酵母的分子生物學(xué)鑒定 通過常規(guī)PCR對分離馴化酵母菌菌株進(jìn)行26 S rDNA擴(kuò)增，得到長度約610 bp片段(圖1)，與預(yù)期片段大小相符。將其測序后得到的序列通過NCBI網(wǎng)站BLAST比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離出的馴化酵母26 S rDNA與原始酵母菌株的同源性為100%，表明所分離的馴化的菌株與原始酵母為同一菌株SaccharomycescerevisiaeS 288c，無變異。將測序得到的序列提交至GenBank，獲得的登錄號為NC-001144.5[10]。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1、2.酵母原始菌株；3、4.酵母馴化株

M.DNA Marker DL 1 000 ；1，2.Original yeast strains；3，4.Domesticated yeast strains

圖1菌株26 S rDNA電泳圖

Fig.1 Electrophoresis of 26 S rDNA amplification products of the strain

2.2 搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

R值可以判斷各因素對試驗指標(biāo)的影響主次，R值越大，此因素水平在本次試驗中的影響越大。由表3可知，對試驗菌含量影響因素從大到小為：溫度>pH>取樣時間。從T值和均值中選擇平均數(shù)大的水平A1、B3、C2作為分析最佳工藝的參考。由表4方差分析表表明，A因素因水平的不同，其平均結(jié)果差異顯著(P<0.05)，而B、C結(jié)果差異不顯著。參考從正交試驗結(jié)果表中選擇平均數(shù)大的水平組合A1B3C2，因該組合在本次試驗方案中不存在，所以，根據(jù)菌含量最大原則，將方案中的最佳處理水平3號進(jìn)行驗證試驗[10]，驗證結(jié)果為3.00×108CFU/mL，得出搖瓶最佳試驗條件：培養(yǎng)溫度25℃，pH為6，取樣時間56 h。

表3 正交試驗結(jié)果

注：Ti為各因素同一水平試驗指標(biāo)之和，R指因素水平的不同造成試驗指標(biāo)的變異。

Note：Tiis the sum of various factors in the same level; R refers to variation of test index in different factor levels.

表4 方差分析

注：P<0.05表示差異顯著；P>0.05表示差異不顯著。

Note：P<0.05 means significant differernce；P>0.05 means no significant difference.

2.3 酵母發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)工藝研究結(jié)果

由表5可知，因試驗系數(shù)R(B)>R(A)>R(C)，所以對試驗影響大小因素的排序為B>A>C，即接種量>轉(zhuǎn)速>裝液量。從表6中T值選擇平均數(shù)大的水平A3、B3、C3組合作為篩選最佳工藝的參考條件。方差分析表明，此模型結(jié)果差異不顯著。將方案中的最佳處理水平9號進(jìn)行驗證試驗，驗證結(jié)果為2.80×108CFU/mL，從而得出發(fā)酵罐最佳工藝條件：轉(zhuǎn)速200 r/min，接種量50 mL/L，裝液量4.5 L。

表5 正交試驗結(jié)果

注：Ti為各因素同一水平試驗指標(biāo)之和，R指因素水平的不同造成試驗指標(biāo)的變異。

Note：Tiis the sum of various factors in the same level; R refers to variation of test index in different factor levels.

3 討論

啤酒酵母因其培養(yǎng)物富含多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)及多種生物活性因子和一些消化酶等多種有利于動物生長且能改善動物腸道微生態(tài)平衡的成分,具有廣闊的前景，越來越多的被應(yīng)用于微生態(tài)制劑，其涉及領(lǐng)域包括臨床應(yīng)用[12]、養(yǎng)殖業(yè)等。有研究發(fā)現(xiàn)，酵母培養(yǎng)物可有效改善反芻動物機(jī)體抗應(yīng)激能力，提高動物生產(chǎn)性能，如在對夏季生長育肥豬生長性能觀察研究中，發(fā)現(xiàn)添加酵母培養(yǎng)物對生長育肥豬的日增重、體重的整齊性有一定的改善[13]，

表6 方差分析

注：P<0.05表示差異顯著；P>0.05表示差異不顯著。

Note：P<0.05 means significant differernce；P>0.05 means no significant difference.

同時，酵母培養(yǎng)物能夠促進(jìn)蛋雛雞免疫器官的發(fā)育，提高其器官指數(shù)[14]。本次試驗通過對酵母培養(yǎng)物的擴(kuò)大培養(yǎng)工藝的研究，將其作為預(yù)防和治療仔豬腹瀉的微生態(tài)制劑，為下一步具體的臨床試驗提供原料，同時也為下一步的規(guī)?；a(chǎn)提供理論數(shù)據(jù)。

林同柱[15]以法夫酵母為出發(fā)菌株，通過改變發(fā)酵工藝，在5 L和50 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了逐步擴(kuò)大工藝試驗的研究。本次試驗在搖瓶培養(yǎng)確定的優(yōu)化條件基礎(chǔ)上，在10 L發(fā)酵罐中研究了裝液量、接種量及轉(zhuǎn)速對啤酒酵母發(fā)酵過程的影響，通過正交實驗篩選出發(fā)酵罐中最佳的生產(chǎn)工藝為：轉(zhuǎn)速200 r/min、接種量50 mL/L及裝液量4.5 L，此條件下酵母菌含量最高達(dá)到2.80×103CFU/mL。發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗中，解決了隨著發(fā)酵規(guī)模擴(kuò)大，因為發(fā)酵罐溶解氧、二氧化碳含量、剪切力等因素造成的目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量下降的影響，有利于提高工業(yè)發(fā)酵的生產(chǎn)效率[5-6]。筆者認(rèn)為，目前所采用的發(fā)酵條件還有較大優(yōu)化空間，如選育活力更強(qiáng)的菌株[16]，加快酵母生長速率，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，進(jìn)行分批補(bǔ)料[17]等，下步試驗也將針對這些問題進(jìn)行設(shè)計，以期能夠得到更優(yōu)化的發(fā)酵結(jié)果。

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IsolationandIdentificationofaDomesticatedBeerYeastStrainandOptimizationofItsExtendedCultivationConditions

XU Jin-qiang1,2,LIANG Hong-yan1，2，ZHAO Wu-jing1,WU Zhong-yong1, CHEN Xin1，2，LI Yu-hui1，2,PU Wan-xia1

(1.LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，KeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceuticalDevelopmentMinistryofAgriculture，KeyLaboratoryofNewAnimalDrugProjectofGansuProvince，Lanzhou，Gansu，730050，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou，Gansu，730070，China)

To screen a domesticated brewer's yeast and to optimize the fermentation process,and to provide experimental data for future mass production.Yeast with good growth ability was isolated and selected from the wort culture medium for morphological, biochemical and molecular biology identification.The orthogonal experiment design was used to optimize the temperature, pH, sampling time and speed of the fermentation tank,liquid volume and inoculation amount.The optimum culture was as follows:the speed was 200 r/min, the inoculation amount was 50 mL/L and the volume of liquid was 4.5 L.The content of live yeasts was 2.8 ×108CFU/mL.The performance was the same before and after domestication.Optimization of the fermentation technology of beer yeast fermentation tank expansion process provided a theoretical reference for large-scale production.

domesticated yeast;biochemical identification; molecular identification; fermentation tank;enlarged culture

2016-12-02

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303038-4)

徐進(jìn)強(qiáng)(1989-),男,陜西漢中人,碩士,主要從事微生物學(xué)與生物制藥研究。*

Q949.326.1

:A

:1007-5038(2017)09-0005-05