林興滔，葛 巖，許 潔，王慧玲，駱新蘭

UroVysion熒光原位雜交技術(shù)在尿路上皮癌細(xì)胞學(xué)檢測(cè)中常見問題分析

林興滔1，葛 巖1，許 潔1，王慧玲2，駱新蘭1

尿路上皮癌；熒光原位雜交；尿液；脫落細(xì)胞

尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤[1]。近年來，尿路上皮癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且易復(fù)發(fā)。尿細(xì)胞學(xué)檢查及膀胱鏡/輸尿管鏡檢是診斷尿路上皮癌的常見手段。前者對(duì)低級(jí)別尿路上皮癌的敏感性偏低，且易受結(jié)石、炎癥等因素的影響而出現(xiàn)假陽性結(jié)果；后者則為有創(chuàng)檢查，費(fèi)用昂貴且不易識(shí)別微小腫瘤[2-3]。遺傳學(xué)研究表明尿路上皮癌易發(fā)生染色體畸變和染色體數(shù)目異常。其中3和17號(hào)染色體的多體性、7號(hào)染色體的三體性、9p21基因的雜合性缺失與尿路上皮癌的發(fā)生及復(fù)發(fā)顯著相關(guān)[4]。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是通過用熒光標(biāo)記的單鏈核苷酸探針，按堿基互補(bǔ)原則和細(xì)胞核內(nèi)與之同源的DNA靶序列結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察是否有染色體變異的技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定、可重復(fù)性好、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前輔助診斷眾多腫瘤的重要方法[5-6]。目前，UroVysion FISH法已通過美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市用于臨床檢測(cè)尿液脫落細(xì)胞，是診斷尿路上皮腫瘤及評(píng)估復(fù)發(fā)的重要方法，在全國(guó)已廣泛開展。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2008～2015年廣東省人民醫(yī)院存檔的500例尿液脫落細(xì)胞學(xué)FISH樣本。

1.2 試劑和儀器 美國(guó)Path Vysis公司UroVysion Bladder Cancer Recurrence Kit探針試劑盒，日本Olympus公司(型號(hào)BX51)熒光顯微鏡，美國(guó)ThermoBrite公司雜交儀(型號(hào)S50024)，水浴鍋，電磁爐，溫度計(jì)，無水乙醇。

1.3 方法 收集至少200 mL尿液標(biāo)本(晨尿最佳)置于離心管中，1 500 r/min離心10 min。去上清，加入5 mL預(yù)熱至37 ℃的0.075 mol/L KCl溶液，吹打懸浮細(xì)胞，37 ℃水浴溫育30 min，期間吹打2～3次。于細(xì)胞低滲混合液中緩慢加入2 mL固定液，混勻，1 500 r/min離心10 min。去上清，加入5 mL固定液，混勻，靜置10 min。離心去上清，根據(jù)細(xì)胞量加適量固定液，制成濃度適宜的細(xì)胞懸液，混勻后滴片。用吸管將細(xì)胞懸液吹打混勻后吸取少量，滴至干凈的載玻片上，自然晾干。室溫下于2×SSC溶液中漂洗玻片2次，每次5 min。將玻片置于37 ℃胃蛋白酶工作液中浸泡5 min。于2×SSC溶液中漂洗玻片2次，每次5 min。然后將玻片依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2 min脫水，自然干燥。10 μL探針滴加于標(biāo)本區(qū)域，切片封固后放入雜交儀75 ℃變性5 min，37 ℃雜交孵育過夜，去封片膠，放入2×SSC中泡掉蓋玻片，置于72 ℃ 0.3%NP40/2×SSC洗2 min，自然晾干。加上DAPI于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 判讀標(biāo)準(zhǔn) 在100倍鏡下觀察膀胱上皮脫落細(xì)胞的FISH結(jié)果并進(jìn)行信號(hào)計(jì)數(shù)。正常細(xì)胞為2個(gè)紅色信號(hào)，2個(gè)綠色信號(hào)，2個(gè)藍(lán)色信號(hào)，2個(gè)金色信號(hào)(圖1)。根據(jù)廠家提供的判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，標(biāo)準(zhǔn)如下：計(jì)數(shù)25個(gè)細(xì)胞，若出現(xiàn)以下兩種情況，則為陽性：(1)若有4個(gè)以上細(xì)胞同時(shí)出現(xiàn)2個(gè)或者更多染色體擴(kuò)增的情況(3、7或17)(圖2)；(2)≥12個(gè)細(xì)胞內(nèi)存在9p21缺失，則為陽性。如果一直為陰性，則應(yīng)全片計(jì)數(shù)，直至出現(xiàn)4個(gè)以上細(xì)胞同時(shí)出現(xiàn)2個(gè)或者更多染色體擴(kuò)增的情況(3、7或17)或≥12個(gè)細(xì)胞內(nèi)9p21缺失，則可判讀為陽性。若計(jì)數(shù)全片后，仍無上述結(jié)果，則為陰性。

①②

圖1 UroVysion FISH陰性結(jié)果 圖2 UroVysion FISH陽性結(jié)果

2 結(jié)果

500例尿液脫落細(xì)胞學(xué)FISH樣本中有12例樣本因細(xì)胞數(shù)量過少而無法判讀，剩余有效病例為488例，陽性率為13.32%，陰性率為86.68%。

3 討論

3.1 尿液標(biāo)本DAPI染色一般情況分析 制片完成后，消化時(shí)應(yīng)用DAPI染色由醫(yī)師來判讀，一方面了解細(xì)胞消化狀態(tài)，一方面對(duì)細(xì)胞數(shù)量、組成成分、細(xì)胞分布及細(xì)胞形態(tài)有初步了解。如所觀察的細(xì)胞學(xué)樣本中尿路上皮細(xì)胞的數(shù)量如何、炎癥細(xì)胞數(shù)量多少、是否存在細(xì)菌，如若存在炎癥細(xì)胞，則應(yīng)明確主要細(xì)胞成分是中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞還是單核細(xì)胞；尿樣中細(xì)胞核比小淋巴細(xì)胞核大1.5～2倍，呈橢圓形或圓形的多為尿路上皮細(xì)胞核。同時(shí)還應(yīng)注意尿路上皮細(xì)胞是散在分布還是成團(tuán)分布；尿路上皮細(xì)胞形態(tài)是正常，還是具有異型性。上述觀察對(duì)于后期FISH觀察有重要的指導(dǎo)作用。3.2 FISH信號(hào)的一般判斷 細(xì)胞學(xué)FISH觀察順序同組織學(xué)的FISH觀察方法，首先在40倍鏡下初步了解是否含有細(xì)菌、細(xì)胞分布是否均一、是否有局部成團(tuán)的細(xì)胞，了解所觀察玻片的一般情況后可轉(zhuǎn)至100倍鏡下進(jìn)行下一步觀察。

3.3 細(xì)胞數(shù)量的控制 細(xì)胞數(shù)量可影響觀察的準(zhǔn)確度。可適當(dāng)控制所需進(jìn)行FISH染色的滴片細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞數(shù)量過多或過少均會(huì)影響觀察的準(zhǔn)確度，特別是尿路上皮細(xì)胞數(shù)量過少，則需要重新收集尿液，否則容易漏診[7]。對(duì)于多次采樣細(xì)胞量均不足的樣本，建議患者排尿前應(yīng)用振動(dòng)按摩器在下腹壁恥骨聯(lián)合上方按摩膀胱20 min后留尿，或取灌洗液，可大大提高送檢標(biāo)本中尿路上皮細(xì)胞的數(shù)量。作者應(yīng)用12孔的玻片，將3、10、30 μL梯度細(xì)胞懸液分別滴于第1、2、3孔，從而保證細(xì)胞數(shù)量。

3.4 混有其他細(xì)胞的處理 根據(jù)混有細(xì)胞種類的不同，處理方式不同：(1)若為女性患者，在樣本收集過程中混入陰道分泌物，從而尿液細(xì)胞中可能混入子宮頸細(xì)胞。此種情況，在HE染色情況下可以區(qū)別，如混入細(xì)胞數(shù)量不多，則不會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響；如混入細(xì)胞數(shù)量較多，在熒光顯微鏡下難以區(qū)分。且如果無法確定尿路上皮細(xì)胞來源將影響最終結(jié)果，有必要建議臨床再次取材送檢。(2)若為男性患者，則有可能混入精液，其內(nèi)的精子在HE玻片中易于辨別：通常細(xì)胞形態(tài)較小，一端稍尖，另一端帶有鞭毛。在熒光顯微鏡下，這些基本形態(tài)依稀可辨，所以對(duì)最終結(jié)果無影響。(3)含大量白細(xì)胞的尿液，此種情況下，炎癥細(xì)胞數(shù)量占多數(shù)，而尿路上皮細(xì)胞數(shù)量少。一般而言，如為急性感染，則尿液中主要的炎癥細(xì)胞為中性粒細(xì)胞，細(xì)胞核多呈分葉狀，此種情況易與尿路上皮細(xì)胞相辨別。如果為慢性感染，則主要炎癥細(xì)胞為淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞，因經(jīng)過FISH消化、洗滌處理后，炎細(xì)胞腫脹不易與尿路上皮細(xì)胞相鑒別，此種情況下，F(xiàn)ISH檢測(cè)容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。處理方法：如混入的淋巴細(xì)胞數(shù)量較少，同時(shí)尿路上皮細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較多且在DAPI通道下難以區(qū)分時(shí)，一般可在白光下根據(jù)細(xì)胞胞質(zhì)的量來確定，淋巴細(xì)胞胞質(zhì)少，而尿路上皮細(xì)胞胞質(zhì)較多，借此加以區(qū)分。如混入的淋巴細(xì)胞數(shù)量較多，同時(shí)尿路上皮細(xì)胞也較少且在DAPI通道下難以區(qū)分時(shí)，一般建議經(jīng)臨床積極抗炎治療后，復(fù)查尿液脫落細(xì)胞FISH結(jié)果。一般經(jīng)過抗炎之后，尿液中白細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而尿路上皮細(xì)胞數(shù)相對(duì)增加，此時(shí)FISH結(jié)果均有較高的可信性及可重復(fù)性。在臨床工作中，部分患者經(jīng)抗炎治療后，復(fù)查FISH結(jié)果，F(xiàn)ISH為陰性者，多為復(fù)雜尿路感染，如尿路結(jié)石，而FISH結(jié)果陽性者多為尿路上皮腫瘤所致的尿路感染，兩者在臨床上均可表現(xiàn)為肉眼血尿。

3.5 結(jié)果判讀 細(xì)胞重疊、破損、未去除細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞核不計(jì)數(shù)，微弱雜交信號(hào)不計(jì)數(shù)，細(xì)胞內(nèi)雜交信號(hào)互相靠近者計(jì)為1個(gè)信號(hào)。一般來說，如果陽性細(xì)胞數(shù)很高或很低，判讀均無疑。但是對(duì)剛好處于閾值的病例而言，則很難判讀陰陽性，此時(shí)，應(yīng)由另外一名醫(yī)師進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)。

FISH用于尿路上皮癌的診斷具有特異性高、敏感性強(qiáng)的特點(diǎn)，但是由于收集的細(xì)胞來源于晨尿中的脫落細(xì)胞，細(xì)胞來源有一定的隨機(jī)性，因而有一定的漏診情況發(fā)生，故應(yīng)對(duì)臨床強(qiáng)調(diào)對(duì)于FISH檢測(cè)的患者最好連送3次樣本以減低漏診的可能。其次，在分子報(bào)告中，如果結(jié)果為陰性，一般要求觀察計(jì)數(shù)全片的尿路上皮細(xì)胞，如在此過程中，觀察計(jì)數(shù)不仔細(xì)或方法不得當(dāng)，仍有一部分漏診可能發(fā)生。如何有效的觀察計(jì)數(shù)，以更大限度的控制漏診的可能則是分子病理醫(yī)師在日常工作中迫切需要解決的問題。

總之，尿液脫落上皮細(xì)胞FISH檢測(cè)是診斷尿路上皮癌或術(shù)后復(fù)查的重要方法，而準(zhǔn)確的判讀則為該方法的有效性提供了保證。然而，目前針對(duì)尿液脫落上皮細(xì)胞的FISH檢測(cè)尚未有規(guī)范化的操作程序或標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)果判讀，而病理醫(yī)師在日常工作中也經(jīng)常會(huì)遇到復(fù)雜的情況。因此，作者總結(jié)了近幾年來UroVysion FISH檢測(cè)中遇到的常見問題供大家參考和討論，旨在進(jìn)一步提高FISH在尿液脫落細(xì)胞中檢測(cè)的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性，以提高其在尿路上皮癌中的早期診斷率及協(xié)助術(shù)后復(fù)發(fā)診斷率。

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廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(A2016284)、廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(A2015048)、廣東省中醫(yī)藥局科研項(xiàng)目(20161006)

1廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)病理醫(yī)學(xué)部病理科，廣州 5100802廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院普通外科，廣州 510080

林興滔，男，主管技師。E-mail: lingxingtao@126.com 駱新蘭，女，主任技師，通訊作者。E-mail: lanx_luo@126.com

時(shí)間：2017-8-20 15:27 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.028.html

R 737

B

1001-7399(2017)08-0933-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.028

接受日期：2017-03-29