閆靜波，衛(wèi) 茹

·短篇論著·

食管胃結合部腺癌中CHK1蛋白的表達及意義

閆靜波1，衛(wèi) 茹2

目的 探討CHK1蛋白在食管胃結合部腺癌中的表達及臨床意義。方法 采用免疫組化和Western blot法檢測141例正常胃黏膜、112例胃黏膜上皮內瘤變及141例食管胃結合部腺癌中CHK1蛋白的表達，并分析其與食管胃結合部腺癌臨床病理征特的關系。結果 從正常胃黏膜組→低級別上皮內瘤變組→高級別上皮內瘤變組→食管胃結合部腺癌組，免疫組化及Western blot檢測結果顯示CHK1蛋白表達分別為9.22%、22.73%、48.53%、79.43%及1、2.40±0.11、5.39±0.37、9.01±1.52，CHK1蛋白表達逐漸上升(P<0.05)。在食管胃結合部腺癌中，CHK1蛋白表達與食管胃結合部腺癌病理分化程度及Lauren分型相關(P<0.05)。結論 CHK1蛋白在食管胃結合部腺癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

食管腫瘤；食管胃結合部腺癌；上皮內瘤變；CHK1；Western blot

細胞周期紊亂可引起基因組的不穩(wěn)定，這與腫瘤的關系密切[1]。細胞周期檢驗點激酶1(checkpoint kinase 1, CHK1)是細胞檢驗點的轉導因子，CHK1在多種腫瘤細胞中高表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移、抗腫瘤細胞凋亡、腫瘤耐藥性等方面密切相關[2]。CHK1能對放療化療所導致的腫瘤細胞DNA損傷進行修復，CHK1高表達容易造成腫瘤對放、化療耐藥[3]。目前CHK1已成為腫瘤研究的潛在靶點之一。近年來食管胃結合部腺癌發(fā)病率明顯上升，腫瘤中心位于胃食管交界(esophagogastric junction, EGJ)及上下各5 cm范圍內的腺癌即為食管胃結合部腺癌，食管胃結合部腺癌最常用的分型是Siewert分型：SiewertⅠ型，腫瘤中心位于EGJ上1～5 cm處，即下段食管癌；SiewertⅡ型，腫瘤中心位于EGJ上1 cm至下2 cm范圍，即賁門癌；SiewertⅢ型，腫瘤位于EGJ下2～5 cm范圍，即賁門下癌[4]。Siewert三種類型，Ⅱ、Ⅲ型相對較多見，Ⅰ型相對較少見[5]。本實驗采用免疫組化法和Western blot法檢測CHK1蛋白在食管胃結合部腺癌標本的表達，對CHK1蛋白在食管胃結合部腺癌的作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2005年～2015年10年內河北醫(yī)科大學附屬邢臺市人民醫(yī)院病理科存檔的食管胃結合部腺癌標本141例，并且經(jīng)過一位病理副主任醫(yī)師診斷，一位病理主任醫(yī)師審核。

1.2 研究分組 食管胃結合部腺癌組141例，胃黏膜上皮內瘤變組112例，正常胃黏膜組141例。各組情況如下：食管胃結合部腺癌組標本共141例，術前均無放、化療：患者男性93例，女性48例；年齡<50歲者56例，≥50歲者85例；腫瘤最大直徑<4 cm 78例，≥4 cm 63例；組織學分化：高分化50例，中+低分化91例；Lauren分型：腸型85例，彌漫型56例；癌組織侵犯黏膜層或黏膜下層(早期胃癌)32例，侵及肌層或漿膜層(中晚期胃癌)109例；無淋巴結轉移者81例，有淋巴結轉移者60例；SiewertⅠ型6例，SiewertⅡ型71例，SiewertⅢ型64例。胃黏膜上皮內瘤變組112例，其中低級別上皮內瘤變44例，高級別上皮內瘤變68例。正常胃黏膜組141例，取自胃癌標本距腫物5 cm遠的胃黏膜。以上三大組標本，均分為兩份：一份經(jīng)10%中性福爾馬林固定，以備HE和免疫組化染色；另一份放入液氮凍存，以備Western blot檢測。

1.3 免疫組化 采用免疫組化EnVision兩步法進行CHK1染色。CHK1蛋白在胞質和胞核表達。(1)按著色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽性細胞數(shù)評分：陽性細胞數(shù)<10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。將兩項得分結果相乘：≥2分為(+)，0～1分為(-)。

1.4 Western blot檢測 對各研究組的蛋白進行提取，參照蛋白標準曲線測定蛋白的含量，做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠內的樣品蛋白轉移至硝酸纖維膜上，5%BSA常溫振蕩封閉1 h。一抗(CHK1抗體)4 ℃過夜，二抗室溫1 h。然后加入堿性磷酸酶顯色劑顯色20 min。用掃描儀掃描NC膜上蛋白表達條帶灰度，用自動圖像分析系統(tǒng)進行定量分析，正常胃黏膜組的平均光密度值(OD值)取值為1，其它各組與正常胃黏膜組相比取值。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理，先做總的χ2檢驗，然后進行兩兩χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用Kaplan-Meier分析CHK1蛋白表達與食管胃結合部腺癌生存期的關系。采用Log-rank單因素分析臨床病理特征與食管胃結合部腺癌生存期的關系。

2 結果

2.1 免疫組化檢測CHK1的表達 免疫組化結果顯示：從正常胃黏膜組→低級別上皮內瘤變組→高級別上皮內瘤變組→食管胃結合部腺癌組，CHK1蛋白表達逐漸上升(P<0.05，表1，圖1)。

表1 免疫組化法檢測正常胃黏膜組、上皮內瘤變組、 食管胃結合部腺癌組中CHK1的表達

2.2 Western blot法檢測CHK1的表達 Western blot結果顯示：從正常胃黏膜組→低級別上皮內瘤變組→高級別上皮內瘤變組→食管胃結合部腺癌組，CHK1蛋白表達逐漸上升(表2，圖2)。

表2 Western blot法檢測正常胃黏膜組、上皮內瘤變組、 食管胃結合部腺癌組中CHK1的表達

圖2 Western blot法檢測CHK1蛋白表達

1.正常胃黏膜組；2.低級別上皮內瘤變組；3.高級別上皮內瘤變組；4.食管胃結合部腺癌組

2.3 CHK1表達與食管胃結合部腺癌臨床病理特征的關系 統(tǒng)計分析顯示，CHK1表達與食管胃結合部腺癌病理分化程度及Lauren分型相關(P<0.05)，CHK1蛋白在中+低分化胃腺癌的表達強于高分化胃腺癌；Lauren分型中，CHK1蛋白在彌漫型胃腺癌中的表達強于腸型胃腺癌(表3)。

表3 CHK1表達與食管胃結合部腺癌臨床病理特征的關系

臨床病理參數(shù)nCHK1陽性陰性陽性率(%)χ2值P值性別 男93712276．341．5950．207 女4841785．42年齡(歲) <5056461082．140．4180．518 ≥5085661977．65腫瘤直徑(cm) <478631580．770．1910．662 ≥463491477．78分化程度 高50341668．006．1980．013 中+低91781385．71Lauren分型 腸型85612471．767．7020．006 彌漫型5651591．07侵犯深度 早期3224875．000．4980．480 中晚109882180．73淋巴結轉移 無81602174．073．3460．067 有6052886．67Siewert分型 Ⅰ65183．33 Ⅱ71561578．870．0140．907 Ⅲ64511379．69

3 討論

近年胃竇癌發(fā)病率逐年下降；相反，食管胃結合部癌的發(fā)病率持續(xù)上升，食管胃結合部腺癌的進展較快，預后較差，約80%的食管胃結合部腺癌發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)晚期，其5年生存率常低于30%[6]。與胃竇癌相比，食管胃結合部腺癌較早深層胃壁浸潤、轉移復發(fā)[7-8]。食管胃結合部腺癌最常用的分型為Siewer分型，SiewertⅢ型預后最差，SiewertⅡ型次之，SiewertⅠ型預后最好。在西方國家，這三型的發(fā)病率基本相同；在我國，SiewertⅠ少見，而SiewertⅡ和Ⅲ多見。肖文光等[9]的研究結果顯示，我國SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分別占3.9%、53.1%、43.0%；楊宏等[10]的研究結果顯示，我國SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分別占4.7%、50.3%、45.0%。本組141例食管胃結合部腺癌中SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分別為6例、71例、64例，所占比例分別為4.3%、50.3%、45.4%，結果與文獻報道基本一致。

ABC

圖1 CHK1在正常胃黏膜組(A)、上皮內瘤變組(B)和食管胃結合部腺癌組(C)中的表達，EnVision兩步法

調控細胞周期是一個復雜的過程，細胞周期檢查點和其蛋白控制著細胞周期，細胞周期檢測點蛋白質缺失會引起細胞周期的紊亂，其紊亂造成基因組不穩(wěn)定，這與腫瘤關系密切[1]。研究細胞周期的調控能夠為探索腫瘤發(fā)生、發(fā)展和腫瘤放、化療的耐藥性提供思路。CHK1是一種細胞檢驗點轉導因子，多數(shù)研究結果顯示在多種腫瘤細胞中CHK1高表達，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移、腫瘤耐藥性等方面發(fā)揮作用[2]，CHK1異常表達會造成細胞周期檢測點對DNA損傷失去修復作用，增加機體腫瘤易感性，引起腫瘤發(fā)生。目前，CHK1已成為腫瘤耐藥性研究的潛在靶點之一，因為CHK1能夠修復放療化療引起的瘤細胞DNA損傷，CHK1其表達水平不但與腫瘤的進展有關，而且與放、化療的效果關系密切，CHK1高表達容易造成腫瘤對放、化療耐藥[3]。

本實驗免疫組化和Western blot檢測結果顯示，從正常胃黏膜組→低級別上皮內瘤變組→高級別上皮內瘤變組→食管胃結合部腺癌組，CHK1蛋白表達逐漸上升(P<0.05)。結果顯示，從正常胃黏膜→低級別上皮內瘤變→高級別上皮內瘤變→高分化腺癌→低分化腺癌，CHK1蛋白表達逐漸上升，結果說明CHK1蛋白可能在食管胃結合部黏膜的癌變及其發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

分析CHK1蛋白與食管胃結合部腺癌臨床病理因素的關系發(fā)現(xiàn)，CHK1表達與患者年齡、性別、侵犯深度、腫瘤大小、Siewert分型及有無淋巴結轉移無關(P>0.05)；然而，CHK1蛋白表達與食管胃結合部腺癌的病理分化程度和Lauren分型相關(P<0.05)。CHK1蛋白在中+低分化胃腺癌的表達強于高分化胃腺癌；Lauren分型中，CHK1蛋白在彌漫型胃腺癌的表達強于腸型胃腺癌；這說明CHK1可能與食管胃結合部腺癌的惡性程度及發(fā)生、發(fā)展有一定的關系，其可能是判斷腫瘤惡性程度高低及分級的重要標志。隨著腫瘤的進展，惡性程度的增高，CHK1蛋白表達升高，提示CHK1蛋白可能促進食管胃結合部腺癌的發(fā)生、發(fā)展。Lauren分型彌漫型胃腺癌CHK1蛋白表達高于腸型胃腺癌，彌漫型胃腺癌主要包括低分化腺癌及印戒細胞癌，惡性程度相對較高，預后較差，而腸型胃腺癌主要指高分化腺癌，惡性程度相對較低，預后較好，仍然提示CHK1蛋白在低分化食管胃結合部腺癌中表達高，CHK1蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用，如果患者CHK1蛋白升高，那么預后較差。

本組實驗中CHK1蛋白在有淋巴結轉移組的表達高于無淋巴結轉移組，CHK1蛋白可能促進食管胃結合部腺癌的淋巴結轉移，有淋巴結轉移的患者預后較差，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

目前，CHK1已成為腫瘤潛在的治療靶點。放、化療能夠造成腫瘤細胞DNA的損傷，CHK1蛋白能夠對這種DNA損傷進行修復。腫瘤細胞能夠利用活化的G2/M期檢測點，延長此期的阻滯，使受損的DNA進行修復，這樣就會引起腫瘤對放化療耐藥[11]。如果腫瘤細胞內CHK1蛋白升高，腫瘤細胞對化療藥物和電離輻射敏感的敏感性降低，腫瘤治療效果欠佳[12]。因此，采用RNA干擾技術，抑制CHK1的表達，消除放化療引起DNA損傷后誘導的G2期阻滯，抑制G2/M期的檢測點，會增加腫瘤細胞凋亡，提高腫瘤細胞對藥物和放射線的敏感性，消除腫瘤細胞的耐藥性[3]。

綜上所述，從正常胃黏膜→低級別上皮內瘤變→高級別上皮內瘤變→高分化腺癌→低分化腺癌，CHK1蛋白表達逐漸上升。CHK1蛋白表達與食管胃結合部腺癌的病理分化程度、Lauren分型有關，作者推測CHK1蛋白促進食管胃結合部腺癌的發(fā)生、發(fā)展及患者預后。深入研究CHK1蛋白在食管胃結合部腺癌的表達及其機制，會給治療食管胃結合部腺癌尋找新的有效途徑。

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閆靜波，男，碩士，副主任醫(yī)師。E-mail: yanjingbo2012@163.com

時間：2017-8-20 15:27 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.017.html

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1001-7399(2017)08-0907-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.017

接受日期：2017-05-09