吳忠練 黃學(xué)寬 駱 言 張超男 蔣 娟 萬 磊 王 玲

(重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 401331)

貝母瓜蔞散對慢性阻塞性肺疾病大鼠p38MAPK和MIP-T3表達(dá)的影響

吳忠練 黃學(xué)寬 駱 言1張超男 蔣 娟 萬 磊 王 玲

(重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 401331)

目的觀察貝母瓜蔞散對慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠肺組織中p38MAPK信號通路和腫瘤相關(guān)因子受體因子MIP-T3的影響。方法將40只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、地塞米松組及貝母瓜蔞散組，每組10只；采用脂多糖(LPS)氣管滴入加煙熏法制造COPD大鼠模型，為期30 d。從造模第8天開始，地塞米松組給予地塞米松注射液腹腔注射(2 mg/kg)，貝母瓜蔞散組給予貝母瓜蔞散灌胃(20 ml/kg)，1次/d，連續(xù)22 d，模型組予0.9% 生理鹽水灌胃(20 ml/kg)。Western印跡檢測p38MAPK蛋白和MIP-T3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果與正常組比較，模型組大鼠肺組織p38MAPK和MIP-T3的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組和貝母瓜蔞散組可降低大鼠肺組織中p38MAPK和MIP-T3的表達(dá)(P<0.05)；而地塞米松組和貝母瓜萎散組p38MAPK和MIP-T3的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論貝母瓜蔞散有抑制p38MAPK和MIP-T3表達(dá)的作用。

貝母瓜蔞散；慢性阻塞性肺疾病；p38MAPK；MIP-T3

氣道炎癥反應(yīng)在慢性阻塞性肺病(COPD)發(fā)病過程中起重要作用，COPD較普通人群更容易發(fā)生肺癌〔1〕。貝母瓜蔞散可潤肺清熱，理氣化痰，尤其方中川貝在我國有廣泛的運(yùn)用〔2〕，在我國咳嗽患者服用川貝蒸梨緩解咳嗽癥狀療效甚佳。瓜蔞可以寬胸理氣，現(xiàn)代研究證明改善心功能和血液流變學(xué)指標(biāo)〔3〕。貝母瓜蔞散出自《醫(yī)學(xué)心悟》卷3：“燥痰澀而難出，多生于肺，肺燥則潤之，貝母瓜蔞散。”冉先德《歷代名醫(yī)良方注釋》“燥痰之證，多由肺陰不足、虛火灼津而成?！毖芯孔C明p38MAPK信號通路是炎癥相關(guān)的信號通路〔4〕，脂多糖(LPS)氣管滴入可刺激大鼠肺泡巨噬細(xì)胞釋放的炎性細(xì)胞因子，腫瘤壞死因子(TNF)和p38MAPK的表達(dá)明顯上升，說明p38MAPK信號通路的激活對炎性細(xì)胞因子和TNF等釋放有促進(jìn)作用。而加入p38MAPK特異性抑制劑，則可抑制MAPK信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)，而減少炎癥介質(zhì)等釋放，減緩COPD發(fā)展進(jìn)程。本實驗觀察貝母瓜蔞散對COPD大鼠肺組織中p38絲裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3結(jié)合蛋白(MIP-T3)1的表達(dá)，作為研究貝母瓜蔞散對COPD大鼠的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1主要試劑與儀器 貝母瓜蔞散(川貝母、瓜蔞、天花粉、茯苓、橘紅、桔梗)，冷水浸30 min，煮沸后煎30 min，共煎3次，合并藥液，濃縮為含2.0 g生藥/ml，購于西部大藥房，由中醫(yī)藥學(xué)院鑒定；地塞米松注射液(山東新華制藥股份有限公司)，SDZ-Ⅱ型電針儀(蘇州醫(yī)療用品有限公司)，LPS(美國Sigma公司)，宏聲牌香煙(川渝中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，焦油量11 mg/支，煙氣CO量12 mg/支，煙氣煙堿量10 mg/支)，MIP-T3抗體(Santa Cruz)，p38MAPK(EPITOMICS)。高速離心機(jī)(美國Sigma)，凝膠成像分析系統(tǒng)(GDS8000，英國UVP公司)，光學(xué)顯微鏡BH-2型(日本Olympus)，顯微攝像儀(Olympus)；多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)Image-Pro Plus(美國Media Cybernetics公司)等。

1.2動物分組與造模 清潔級雄性SD大鼠，40只，體重(200±20)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供〔生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2007-0001〕。將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、地塞米松組和貝母瓜蔞散組，每組10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，除正常組外，參照宋一平等〔5〕的方法，將其余30只大鼠分別于第1、15天氣道內(nèi)注入LPS生理鹽水溶液(200 μg/100 μl)；第2～14天、16～30天則將大鼠置于密閉玻璃染毒箱中，香煙插在50 ml注射器針頭上，點燃并抽推活塞，將產(chǎn)生的煙霧注入箱內(nèi)，濃度達(dá)5%左右(每次約打入3 600 ml煙霧)，使大鼠被動吸煙，持續(xù)30 min后再將大鼠移出染毒箱，2次/d，每次間隔4 h以上，其余時間正常喂養(yǎng)。造模過程注意觀察大鼠的一般情況。實驗過程中對動物處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.3治療方法 實驗造模第8天起，正常組：不造模，每日予以0.9%生理鹽水20 ml/kg連續(xù)灌胃，1次/d，連續(xù)22 d。模型組：造模，每日予以0.9% 生理鹽水20 ml/kg灌胃，每日1次，連續(xù)22 d。地塞米松組：造模，用地塞米松注射液腹腔注射(2 mg/kg)，1次/d，連續(xù)22 d。貝母瓜蔞散組：造模，用貝母瓜蔞散20 ml/kg灌胃，每日1次，連續(xù)22 d。

1.4肺組織病理觀察及p38MAPK、MIP-T3表達(dá)的測定 解剖取出大鼠的肺，用生理鹽水洗凈肺組織表面殘血，濾紙吸干后，精密稱取0.1 g肺組織研磨，滴加蛋白裂解液0.5 ml使之裂解。低溫4℃離心10 min(3 000 r/min)，取上清液。在上樣緩沖液中加入100 μg蛋白煮沸3分，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，37℃ TTBS封閉液封閉2 h，滴加兔抗鼠p38MAPK、MIP-T3單克隆抗體，4℃冰箱內(nèi)過夜，加1∶2 500辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，37℃放置2 h，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色?？贵w剝脫液剝脫抗體后，相同方法與1∶300的β-actin抗體孵育。內(nèi)參以β-actin 蛋白條帶為準(zhǔn)，分析灰度值，計算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般狀態(tài)及肺組織病理學(xué)改變 與正常組比較，模型組大鼠明顯出現(xiàn)了咳嗽、喘、精神不振、張口抬頭、口角流涎等。經(jīng)過貝母瓜蔞散和地塞米松干預(yù)的大鼠上述癥狀和體征明顯減輕或消失。實驗結(jié)束后，正常大鼠肺組織顏色偏白，而模型組大鼠肺組織灰白晦暗呈膨隆狀，地塞米松組和貝母瓜蔞散組大鼠肺組織顏色灰暗明顯較模型組好轉(zhuǎn)。

2.2大鼠肺組織p38MAPK和MIP-T3蛋白的表達(dá) 與正常組比較，模型組肺組織p38MAPK和MIP-T3的表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組和貝母瓜蔞散組p38MAPK和MIP-T3的表達(dá)明顯下降(P<0.05)；而地塞米松組和貝母瓜組相比，兩者無顯著性差異(P>0.05)。見表1，圖1。

表1 大鼠肺組織中p38MAPK和MIP-T3表達(dá)灰度值(±s)

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

1正常組；2模型組；3地塞米松組；4貝母瓜蔞散組圖1 各組肺組織p38MAPK和MIP-T3的表達(dá)

3 討 論

COPD是以進(jìn)行性氣流受限為特征的慢性疾病，與香煙煙霧等有害氣體或粉塵顆粒等引起的肺部異常炎癥反應(yīng)相關(guān)，主要病理改變是慢性炎癥所致的氣道損傷、修復(fù)、重塑等，與COPD的發(fā)病密切相關(guān)。本實驗通過氣管滴注LPS和被動吸煙法制備COPD大鼠模型。

炎癥反應(yīng)中p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路占很重要地位，它參與細(xì)胞存活、分化和發(fā)育等過程，實驗表明p38MAPK能增強(qiáng)細(xì)胞存活概率，也能抗凋亡。特別在炎癥反應(yīng)時抗凋亡能力更強(qiáng)〔6〕。研究顯示，p38MAPK可能參與支氣管哮喘的發(fā)病過程〔7〕。另外，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)是TNF超家族成員之一，不僅能加強(qiáng)TNFR誘導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生〔8〕，還與炎癥細(xì)胞的分化有關(guān)，介導(dǎo)機(jī)體自然免疫和獲得性免疫〔9〕。MIP-T3，可能參與胞質(zhì)中合成的纖毛蛋白運(yùn)送到纖毛內(nèi)組裝的過程。在MIP-T3突變、缺陷和敲除后纖毛會出現(xiàn)不同程度的改變，如纖毛稀疏、短小、微管結(jié)構(gòu)缺陷或紊亂。人體觀察發(fā)現(xiàn)MIP-T3在人體很多組織中，比如在支氣管、肺組織都有表達(dá)。COPD患者存在氣道上皮纖毛結(jié)構(gòu)和功能的異常，纖毛的異常會導(dǎo)致黏液纖毛清除功能的障礙，引起分泌物異常分泌，小氣道受阻，局部防御系統(tǒng)破壞，引起反復(fù)炎癥反應(yīng)及感染，是疾病反復(fù)發(fā)生并漸漸加重的關(guān)鍵原因之一〔10〕。纖毛的結(jié)構(gòu)和功能異常在COPD的發(fā)病中起重要作用。另外，TRAF腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子在肺癌患者肺組織中表達(dá)明顯升高〔11〕。

本文結(jié)果顯示貝母瓜蔞散可以抑制p38MAPK信號通路，抑制COPD大鼠肺組織的炎癥反應(yīng)。對MIP-T3的抑制可能反映了貝母瓜蔞散能通過抑制COPD的炎性反應(yīng)從而抑制了COPD惡性病變的趨勢。

1薄曉霞,彭 芳,謝美云,等.慢性阻塞性肺病合并肺癌臨床分析〔J〕.中國實用醫(yī)藥,2012;7(10):132-3.

2顏曉燕,彭 成.川貝母藥理作用研究進(jìn)展〔J〕.中國藥房,2011;22(31):2963-5.

3張承志,韓林濤,黃 芳,等.“瓜蔞-薤白”藥對大鼠抗急性心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用〔J〕.湖北中醫(yī)雜志,2012;34(7):19-21.

4黃翠萍,張珍祥,徐永健,等.p38蛋白激酶對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞活化機(jī)制的調(diào)控〔J〕.中國病理生理雜志,2003;19(5):661-3.

5宋一平,崔德健,茅培英,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及藥物干預(yù)〔J〕.中華內(nèi)科雜志,2000;39(8):556-7.

6梁先敏,楊克敵.Caspase和JNKPSAPK、p38MAPK與細(xì)胞凋亡〔J〕.國外醫(yī)學(xué)·衛(wèi)生學(xué)分冊,2008;35(1):5-10.

7黃翠萍,楊和平,楊穎喬,等.黃芪注射液對哮喘大鼠p38MAPK和Th1/Th2類細(xì)胞因子變化的影響〔J〕.中國病理生理雜志,2008;24(12):2386-90.

8Wicovsky A,Henkler F,Salzmann S,etal.Tumor necrosis factor receptor-associated factor-1 enhances proinflammatory TNF receptor-2 signaling and modifies TNFR1-TNFR2 cooperation〔J〕.Oncogene,2009;28(15):1769-81.

9Dupoux A,Cartier J,Cathelin S,etal.clAP1-dependent TRAF2 degradation,regulates the differentiation of monocytes into macrophages and their response to CD40 ligand〔J〕.Blood,2009;113(1):175-85.

10高志睿.MIP-T3在慢性阻塞性肺疾病患者呼吸道上皮的表達(dá)研究〔D〕.廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2011.

11黃建安,王天立,王光杰,等.CD40配基化對肺癌細(xì)胞腫瘤壞死因子受體及相關(guān)因子表達(dá)的影響〔J〕.江蘇醫(yī)藥雜志,2004;30(9):641-3.

〔2016-05-13修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

重慶市渝中區(qū)科技項目(No.20110318)

黃學(xué)寬(1972-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)基礎(chǔ)理論與臨床研究。

吳忠練(1960-)，男，講師，主要從事中醫(yī)經(jīng)典及臨床運(yùn)用研究。

R289.5

A

1005-9202(2017)16-3936-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.012

1 重慶市中醫(yī)院