張 劍 肖 樂 郭曉東 侯德智 龔昆梅 歐陽一鳴

(云南省第一人民醫(yī)院 昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院普外一科，云南 昆明 650034)

下肢動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miRNA-199a-3p對外周血單核細(xì)胞的影響

張 劍 肖 樂 郭曉東 侯德智 龔昆梅 歐陽一鳴

(云南省第一人民醫(yī)院 昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院普外一科，云南 昆明 650034)

目的探討下肢動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miRNA-199a-3p對外周血單核細(xì)胞的影響。方法選取37例下肢動脈粥樣硬化閉塞癥(AS)患者外周血為AS組。另外選取同期37名健康體檢者外周血為對照組。新鮮血管組織取自1例下肢AS患者截肢遠(yuǎn)端血管為實(shí)驗(yàn)組，以其截肢近端血管為對照。實(shí)時熒光定量PCR檢測新鮮血管組織，分離得到的外周血中單核細(xì)胞和微泡中miRNA-199a-3p表達(dá)水平。以人單核細(xì)胞TTHP-1為載體，miRNA-199a-3p mimics組和miRNA-199a-3p inhibitor組分別轉(zhuǎn)染miRNA-199a-3p mimics和miRNA-199a-3p inhibitor，同時設(shè)置空白對照組。實(shí)時熒光定量PCR檢測各組miRNA-199a-3p、趨化因子單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、調(diào)解活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的趨化因子(RANTES)和Fractalkine表達(dá)水平。結(jié)果下肢動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miRNA-199a-3p表達(dá)水平顯著高于正常組織(P<0.05)。AS組外周血單核細(xì)胞和微泡中miRNA-199a-3p表達(dá)水平均顯著高于對照組(P<0.05)。與空白對照組相比，miRNA-199a-3p mimics組miRNA-199a-3p表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，miRNA-199a-3p inhibitor組miRNA-199a-3p表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。與空白對照組相比，miRNA-199a-3p mimics組MCP-1、RANTES和Fractalkine的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miRNA-199a-3p inhibitor組MCP-1、RANTES和Fractalkine的mRNA表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)。結(jié)論動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞高表達(dá)miRNA-199a-3p，并以微泡形式分泌到外周血中，抑制單核細(xì)胞中MCP-1、RANTES和Fractalkine等趨化因子的表達(dá)，是一種動脈粥樣硬化保護(hù)因素。

動脈粥樣硬化；miRNA-199a-3p；單核細(xì)胞；趨化因子

下肢動脈粥樣硬化閉塞癥(AS)是由于動脈粥樣硬化導(dǎo)致下肢動脈狹窄、閉塞的缺血性疾病，是全身性動脈粥樣硬化的局部表現(xiàn)，總體發(fā)病率在3%～10%，且隨著年齡的增長而增加，在70歲以上的人群中發(fā)病率上升至15%～20%〔1〕。下肢AS是一個多因素共同參與的過程〔2〕，單核-巨噬細(xì)胞對氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)識別、吞噬和泡沫細(xì)胞形成在動脈粥樣硬化過程中具有重要作用〔3〕。微泡(MV)是一類由正?；虍惓＜?xì)胞分泌至外周血循環(huán)或周圍組織液中的微小囊泡狀結(jié)構(gòu)的統(tǒng)稱，根據(jù)其直徑大小可以分為微粒(microparticle，直徑100～1 000 nm)和外泌小體(exosome，直徑30～100 nm)〔4〕。MV內(nèi)部包裹著蛋白、DNA、mRNA和微小RNA(miRNA)等，其表面脂質(zhì)磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)上的蛋白具有抗原性并為多種受體識別。研究證實(shí)，MV與動脈粥樣硬化具有密切關(guān)系，其內(nèi)攜帶的miRNA具有調(diào)控mRNA表達(dá)的作用〔5〕。本文通過分析miRNA-199a-3p在粥樣斑塊中的表達(dá)水平，探討其對外周血單核細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程的影響。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 選取2016年10～12月在云南省第一人民醫(yī)院收治的37例下肢AS患者外周血為AS組。入選標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前影像學(xué)檢查示下肢動脈存在多節(jié)段、復(fù)雜病變；患者知情同意后，能夠自愿配合參與調(diào)查研究。排除合并惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全者和孕婦。另外選取同期37名健康體檢者外周血為對照組。新鮮血管組織取自就診于該院的1例下肢AS患者截肢遠(yuǎn)端血管為實(shí)驗(yàn)組，以其截肢近端血管為對照。

1.2主要儀器及試劑 超凈工作臺(AIRTECH，蘇凈集團(tuán)安泰公司)；紫外分光光度計(N2S，上海儀電分析儀器有限公司)；臺式低溫高速冷凍離心機(jī)(3K3，Sigma，美國)；定量 PCR 儀(ABI step one plus，美國)；普通酶標(biāo)儀(DG-3022，美國)；BD Influx 流式細(xì)胞分選儀(BD公司，美國)；NanoDrop超微量分光光度儀(Thermo Fisher Scientific，美國)。

DMEM低糖培養(yǎng)基(GIBCO公司)；人單核細(xì)胞TTHP-1(上海哈靈生物有限公司)；miRNA熒光定量PCR檢測試劑、miRNA-199a-3p特異引物試劑盒、miRNA-199a-3p mimics、miRNA-199a-3p inhibitor、miRNA 提取試劑盒(MirVana miRNA isolation Kit AMI 560 Ambion，美國)；Trizol (Invitrogen，美國)；磷酸鹽緩沖液(PBS，Sigma公司，美國)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3血管組織miRNA-199a-3p表達(dá)水平檢測 采用莖環(huán)引物的SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-199a-3p的表達(dá)水平。取新鮮血管組織標(biāo)本，提取總RNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。經(jīng)NanoDrop超微量分光光度儀檢測提取的RNA濃度及質(zhì)量。miRNA-199a-3p上游引物5′-ACACCAGCTGGGTACAGTAGTCTGCACA-3′，下游引物5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′。以小核RNA的U6 RNA作為內(nèi)參，U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR Green supermix 12.5 μl，cDNA模板2 μl，RNase Free H2O 8 μl，上、下游引物各1 μl；反應(yīng)條件：95℃30 s，95℃5 s，60℃20 s，72℃20 s，共循環(huán)45次。

1.4MV中miRNA-199a-3p表達(dá)水平檢測 外周血加入PBS(1∶7)稀釋后，離心(100 000 r/min，2 h)，棄去上清，所得沉淀即為抽提的MV，PBS懸浮，置于-80℃冰箱保存。采用實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-199a-3p的表達(dá)水平，方法同1.3。

1.5單核細(xì)胞中miRNA-199a-3p表達(dá)水平檢測 新鮮外周血中加入等量6%右旋糖酐溶液，室溫靜置60 min，將上層液移入另一試管中，加入無Ca2+、Mg2+的Hank液，混勻，離心(2 000 r/min，10 min)，棄上清。相同方法再洗滌2次。以CD68為單核細(xì)胞標(biāo)志物，采用BD Influx 流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行分選，留取單核細(xì)胞。采用實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-199a-3p的表達(dá)水平，方法同1.3。

1.6單核細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染過程 從液氮罐中取出人單核細(xì)胞TTHP-1凍存管，復(fù)蘇后，采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(5%CO2、37℃)下繼續(xù)培養(yǎng)，離心后傳代或換液，維持細(xì)胞單個、圓、亮的懸浮狀態(tài)。至細(xì)胞對數(shù)生長期，分為空白對照組、miRNA-199a-3p mimics組和miRNA-199a-3p inhibitor組，每組設(shè)置6個復(fù)孔，用無血清培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染FuGENE、miRNA-199a-3p mimics和miRNA-199a-3p inhibitor，靜置15 min后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(5% CO2、37℃)下繼續(xù)培養(yǎng)3 d后收集細(xì)胞，提取總RNA，嚴(yán)格按說明書操作，經(jīng)NanoDrop超微量分光光度儀檢測所提取RNA濃度及質(zhì)量。采用實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-199a-3p的表達(dá)水平，方法同1.3。

1.7趨化因子檢測 各組單核細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時熒光定量PCR檢測趨化因子單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、調(diào)解活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的趨化因子(RANTES)和Fractalkine。MCP-1上游引物5′-CAGCCAGATGCAATCAATGCC-3′，下游引物5′-TGGAATCCTGAACCCACTTCT-3′。RANTES上游引物5′-ATCCTCATTGCTACTGCCCTC-3′，下游引物5′-GCCATTGGTTAAGAAATACTCC-3′。 Fractalkine上游引物5′-ACCACGGTGTGACGAAATG-3′，下游引物5′-CTCCAAGATGATTGCGCGTTT-3′。 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，共循環(huán)40次。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件，計量資料行t檢驗(yàn)，計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1血管組織miRNA-199a-3p表達(dá)水平 動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miRNA-199a-3p表達(dá)水平(8.51±3.03)顯著高于正常組織(3.62±1.22)(P<0.05)。

2.2單核細(xì)胞和MV中miRNA-199a-3p表達(dá)水平 AS組外周血單核細(xì)胞(0.86±0.12)和MV中(6.31±1.25)miRNA-199a-3p表達(dá)水平均顯著高于對照組(0.35±0.09，3.05±0.58)(P<0.05)。

2.3各組單核細(xì)胞miRNA-199a-3p表達(dá)水平 與空白對照組(1.00±0.12)相比，miRNA-199a-3p mimics組miRNA-199a-3p表達(dá)水平(1.81±0.15)顯著上升(P<0.05)，miRNA-199a-3p inhibitor組miRNA-199a-3p表達(dá)水平(0.44±0.09)顯著下降(P<0.05)。

2.4MCP-1、RANTES和Fractalkine的mRNA表達(dá)水平 與空白對照組相比，miRNA-199a-3p mimics組MCP-1、RANTES和Fractalkine的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miRNA-199a-3p inhibitor組MCP-1、RANTES和Fractalkine的mRNA表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)。見圖1。

與空白對照組比較:1)P<0.05圖1 各組單核細(xì)胞MCP-1、RANTES和FractalkinemRNA表達(dá)水平

3 討 論

下肢AS好發(fā)于大中型動脈，最易受累的部位包括小腿股腘動脈、脛腓動脈和主髂動脈，臨床表現(xiàn)為靜息痛、間歇性跛行、難治性潰瘍等。

本組數(shù)據(jù)顯示，動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miRNA-199a-3p呈高表達(dá)狀態(tài)。miRNA-199a-3p基因定位于19號染色體p13.2的DNM2基因16號內(nèi)含子內(nèi)，在多個腫瘤中證實(shí)存在高表達(dá)，如結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌、膀胱癌等，可能具有促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生與進(jìn)展的作用〔6〕。miRNA-199a-3p與動脈粥樣硬化關(guān)系的研究還十分有限。本文結(jié)果顯示AS組外周血單核細(xì)胞和MV中miRNA-199a-3p表達(dá)水平均顯著高于對照組，由此可見動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞表達(dá)的miRNA-199a-3p可能通過MV形式分泌入外周血，被單核細(xì)胞吞噬，從而對其造成影響，與曾慶壇等〔7〕報道一致。

本文在細(xì)胞水平通過將miRNA-199a-3p mimics和miRNA-199a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染進(jìn)單核細(xì)胞，提示miRNA-199a-3p mimics和miRNA-199a-3p inhibitor成功轉(zhuǎn)染，并分別上調(diào)和抑制了miRNA-199a-3p的表達(dá)水平；并且miRNA-199a-3p具有抑制單核細(xì)胞內(nèi)MCP-1、RANTES和Fractalkine表達(dá)的作用。

趨化因子在動脈粥樣硬化形成過程中起到至關(guān)重要的作用〔8〕。最新研究顯示，血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等分泌的趨化因子RANTES(CCL5/CCR5)、MCP-1 (CCL2/CCR2)和Fractalkine(CX3CL1/CX3CR1)與動脈粥樣硬化斑塊的形成過程具有緊密關(guān)系。RANTES屬于CC趨化因子家族，主要通過結(jié)合CCR5，作用于嗜酸粒細(xì)胞、T細(xì)胞和單核細(xì)胞上，趨化其進(jìn)入內(nèi)皮下促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的形成〔9〕。MCP-1具有調(diào)節(jié)單核細(xì)胞黏附及遷移進(jìn)入動脈壁的作用，還具有趨化和促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖的作用，直接或間接地參與了動脈粥樣硬化斑塊的形成過程〔10〕。Fractalkine屬于CX3C家族趨化因子，主要與受體CX3CR1結(jié)合，從而參與動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)過程〔11〕。

綜上所述，動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞高表達(dá)miRNA-199a-3p，并以MV形式分泌到外周血中，抑制單核細(xì)胞中MCP-1、RANTES和Fractalkine等趨化因子的表達(dá)，是一種動脈粥樣硬化保護(hù)因素。

1鄧 堯，謝明星，呂 清，等.下肢動脈粥樣硬化閉塞癥患者頸動脈僵硬度改變與左心室舒張功能關(guān)系的超聲評價〔J〕.中華超聲影像學(xué)雜志，2012；21(10)：842-5.

2廖偉光，謝治惟，陳仕章.ACEI (ARB)，辛伐他汀，阿司匹林聯(lián)用早期干預(yù)下肢動脈粥樣硬化血管閉塞癥的臨床研究〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012；10(2)：229-30.

3Van Wagner LB，Ning H，Lewis CE，etal.Associations between nonalcoholic fatty liver disease and subclinical atherosclerosis in middle-aged adults：the Coronary Artery Risk Development in Young Adults Study〔J〕.Atherosclerosis，2014；235(2)：599-605.

4Li KY，Zheng L，Wang Q，etal.Characteristics of erythrocyte-derived microvesicles and its relation with atherosclerosis〔J〕.Atherosclerosis，2016；255(6)：140-4.

5Wagner S,Schorr J,Ludwig A,etal.Contrast-enhanced MR imaging of atherosclerosis using citrate-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles：calcifying microvesicles as imaging target for plaque characterization〔J〕.Int J Nanomed，2013；8(12)：767-79.

6Tian R，Xie X，Han J，etal.miR-199a-3p negatively regulates the progression of osteosarcoma through targeting AXL〔J〕.Am J Cancer Res，2014；4(6)：738-50.

7曾慶壇，郝長寧，闞科佳，等.動脈粥樣斑塊內(nèi)微小核糖核酸-199a 抑制單核細(xì)胞炎性反應(yīng)〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2016；33(12)：2688-90

8Kimura S，Wang KY，Yamada S，etal.CCL22/macrophage-derived chemokine expression in apolipoprotein e-deficient mice and effects of histamine in the setting of atherosclerosis〔J〕.J Atheroscler Thromb，2014；22(6)：599-609.

9Zhong ZX，Li B，Li CR，etal.Role of chemokines in promoting instability of coronary atherosclerotic plaques and the underlying molecular mechanism〔J〕.Braz J Med Biol Res，2015；48(2)：161-6.

10Mikolajczyk TP，Nosalski R，Szczepaniak P，etal.Role of chemokine RANTES in the regulation of perivascular inflammation，T-cell accumulation，and vascular dysfunction in hypertension〔J〕.FASEB J，2016；30(5)：1987-99.

11Sindhu S，Koshy M，Al-Roub AA，etal.Differential association of plasma monocyte chemoattractant protein-1 with systemic inflammatory and airway remodeling biomarkers in type-2 diabetic patients with and without asthma〔J〕.J Diabetes Metab Disord，2016；15(1)：40.

〔2017-03-22修回〕

(編輯 袁左鳴)

EffectsofmiRNA-199a-3pinatheroscleroticplaqueonperipheralbloodmononuclearcells

ZHANGJian,XIAOLe,GUOXiao-Dong,etal.

GeneralSurgicalDepartmentoftheFirstPeople'sHospitalofYunnanProvince,KunhuaAffiliatedHospitalofKunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650034,Yunnan,China

ObjectiveTo investigate the effect of miRNA-199a-3p in atherosclerotic(AS) plaque on peripheral blood mononuclear cells.MethodsTwenty patients with arterial atherosclerosis were treated as AS group. In addition, 37 healthy subjects were selected as the control group. Fresh blood vessels were taken from 1 patient with AS who had been treated. The expression of miRNA-199a-3p in blood vessels, peripheral blood mononuclear cells and microbubbles were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. miRNA-199a-3p mimics group and miRNA-199a-3p inhibitor group were transfected with miRNA-199a-3p mimics and miRNA-199a-3p inhibitor, and the blank control group was set up with human monocyte TTHP-1 as the vector. The levels of miRNA-199a-3p, chemokine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), RANTES and Fractalkine were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.ResultsThe expression of miRNA-199a-3p in AS plaques was significantly higher than that in normal tissues (P<0.05). The expression of miRNA-199a-3p in peripheral blood mononuclear cells and microbubbles of coronary heart disease group were significantly higher than those of control group (P<0.05). Compared with that of blank control group, the expression level of miRNA-199a-3p in miRNA-199a-3p mimics group was significantly increased (P<0.05), miRNA-199a-3p expression level in miRNA-199a-3p inhibitor group was significantly decreased (P<0.05). Compared with those of blank control group, the mRNA expressions of MCP-1, RANTES and Fractalkine in miRNA-199a-3p mimics group were significantly decreased (P<0.05), mRNA expression of MCP-1, RANTES and Fractalkine in miRNA-199a-3p inhibitor group were significantly increased (P<0.05).ConclusionsmiRNA-199a-3p is highly expressed in macrophages of AS plaques and secreted into peripheral blood in microbubbles to inhibit the expressions of chemokines such as MCP-1, RANTES and Fractalkine in monocytes. miRNA-199a-3p is a protective factor for atherosclerosis.

Atherosclerosis; miRNA-199a-3p; Monocytes; Chemokines

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260066)；云南科技計劃項(xiàng)目(2013FB199)

龔昆梅(1967-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事血管外科研究。

張 劍(1977-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事血管外科研究。

R543.5

A

1005-9202(2017)16-3917-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.004