羅招凡 李芳萍 程 樺

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510120)

抵抗素上調脂肪酸轉位酶表達對HepG2 細胞脂質積聚的作用

羅招凡 李芳萍1程 樺1

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510120)

目的探討抵抗素在棕櫚酸誘導下對HepG2肝細胞脂質積聚的作用及其對脂肪酸轉位酶(FAT/CD36)表達調控的影響。方法50 ng/ml重組人抵抗素及0.5 mmol/L棕櫚酸孵育HepG2肝細胞，之后用100 nmol/L胰島素處理，采用實時定量RT-PCR檢測膽固醇調節(jié)元件結合蛋白(SREBP)1 mRNA水平，流式細胞儀檢測胞膜CD36表達，尼羅紅(Nile Red)染色后激光共聚焦顯微鏡檢測胞內脂質含量。結果與對照組相比，抵抗素增加胞膜FAT/CD36含量(P<0.05)，促進HepG2細胞SREBP1 mRNA表達(P<0.05)，使胞內紅色脂肪小滴增多(P<0.05)。結論在高濃度游離飽和脂肪酸環(huán)境中，抵抗素在基礎及胰島素刺激狀態(tài)下通過上調HepG2 的CD36 表達，刺激SREBP1轉錄，導致HepG2肝細胞內脂質積聚。

抵抗素；胰島素；CD36；脂質積聚

脂毒性是指血中游離脂肪酸(FFA)水平升高后，超過脂肪組織的儲存能力和各組織對FFA的氧化能力，使過多的FFA以甘油三酯(TG)等形式在非脂肪組織中過度沉積而造成對該組織的損傷。FFA與胰島素抵抗(IR)密切相關，脂肪的異位沉積已被認為是形成IR的重要因素，而肝臟是最易也是較早發(fā)生脂肪異位沉積的部位。抵抗素參與調節(jié)糖代謝和導致IR〔1〕。以往人抵抗素對IR的體外研究多集中在內皮細胞及單核巨噬細胞，在肝細胞中的資料相對較少；而在高FFA環(huán)境中，人抵抗素是否會導致肝細胞脂代謝紊亂，是否會形成肝細胞內脂肪聚積，目前研究資料更是少見。脂肪酸轉運酶(FAT/CD36)是一種膜糖蛋白，屬于B 類清道夫受體家族，廣泛分布于哺乳動物的多種組織細胞上，包括肝細胞、心肌和骨骼肌細胞、脂肪細胞等，在介導棕櫚酸的跨膜轉運中起著重要作用〔2〕。本課題擬研究抵抗素在棕櫚酸誘導下對HepG2細胞脂質積聚的作用，并探討其對FAT/CD36的表達調控。

1 材料與方法

1.1材料及主要試劑 抵抗素(美國Phoenix.Inc)；棕櫚酸(美國Sigma公司)；胰島素(Humulin，40 IU/ml，Lily公司)；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(BSA)(美國Gibco公司)；PE鼠抗CD36抗體(美國BD PharmingenTM公司)；尼羅紅(Nile Red)熒光染料(美國Sigma公司)；SYBR GreenⅠPCR 通用混合試劑(美國Applied Biosystems公司)。

1.2方法

1.2.1FFAs的配制 首先在37℃水浴中，將棕櫚酸溶解于無水乙醇中配制成50 mmol/L的棕櫚酸儲存液。臨用前37℃水浴按0.5%的濃度將BSA溶解于DMEM中，之后將棕櫚酸儲存液與含0.5% BSA(w/v)的DMEM混合并攪動1 h配制成500 μmol/L棕櫚酸工作液，按比例加入4% BSA攪動10 min混勻，過濾除菌，4℃儲存。

1.2.2Nile Red熒光染料的配制 取10 mg Nile Red溶解于100 ml丙酮，配制成0.1 mg/ml的Nile Red儲存液，避光保存，臨用時按1∶100稀釋。

1.2.3細胞培養(yǎng)及分組干預 HepG2細胞用含50 ng/ml抵抗素(res50組)或不含抵抗素(res0組)的低糖DMEM培養(yǎng)液處理24 h，之后用去血清的無糖DMEM培養(yǎng)液(仍含對應濃度)饑餓3～5 h，然后用含0.5 mmol/L棕櫚酸的低糖DMEM培養(yǎng)液處理16 h，接著用不含胰島素或含100 nmol/L胰島素的低糖DMEM培養(yǎng)液處理2 h，依次收集細胞行后續(xù)實驗。

1.2.4RNA的提取及實時定量RT-PCR檢測mRNA水平 收集細胞，用TRIZOL試劑分離提取總RNA，逆轉錄成cDNA，用SYBR GreenⅠ實時定量PCR進行擴增，擴增條件為95℃變性10 min，然后95℃15 s，60℃1 min，共40個循環(huán)。在PCR反應結束后采用溶解曲線方法驗證反應的特異性。實驗結果以管家基因18sRNA的循環(huán)閾值(Ct)作標準化，稱為ΔCt，最終各基因的表達結果為2-ΔΔCT，其中-ΔΔCT 等于處理組的ΔCt減去對照組的ΔCT，對照組的2-ΔΔCT值為1。膽固醇調節(jié)元件結合蛋白(SREBP)1基因引物用Primer Express 2.0軟件設計，其特異性及有效性在實驗前均被證實。引物序列：SREBP1(NM_001005291)前向引物：5′-GCTCCTCCATCAATGACAAAATC-3′，反向引物：5′- TGCAGAAAGCGAATGTAGTCGAT-3′；18sRNA(NR_003286)前向引物：5′-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3′，反向引物：5′-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3′。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞膜CD36含量 取6孔板中一定量HepG2細胞(約1×106個細胞/ml)，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用4%多聚甲醛1 ml室溫固定40 min，離心去上清，加2 ml PBS重懸洗滌，再用1 ml含5%人血清的PBS重懸細胞，冰上孵育10 min，800 r/min離心5 min去上清。加入200 μl含0.5%BSA和飽和劑量熒光標記抗體(5×105個細胞/20 μl抗體)的PBS，避光冰上放置30 min，離心棄上清。加入200 μl 1%多聚甲醛固定，最后用流式細胞儀檢測熒光值，每管計數(shù)1×104個細胞。以流式細胞儀的配套軟件分析樣品中細胞的相應標記陽性表達率。

1.2.6Nile Red染色激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內脂質含量 取24孔板中HepG2細胞去培養(yǎng)基，用冰的PBS洗1次，每孔加1 ml 1.5%戊二醛固定5 min之后移去固定液或無須固定，之后每孔加1 ml PBS，隨即加入10 μl Nile Red染液(0.1 mg/ml)，至少孵育5 min，立即置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，激發(fā)光波長450～500 nm，發(fā)射光波長>528 nm。正常的HepG2細胞內未見或僅見很少脂肪小滴，而有脂質沉積的HepG2細胞則見紅色或桔紅色的脂肪小滴。激光共聚焦顯微鏡下計算HepG2細胞中脂肪小滴所占比例，0、1/4、1/2、3/4或滿視野為界定范圍，評估脂質含量為0～4分，每樣本隨機計數(shù)25個細胞。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件，實驗用不同批次細胞重復3次以上。組間比較采用方差分析(ANOVA)，方差齊性則多組間比較采用Scheffe檢驗，非正態(tài)數(shù)據(jù)多組間比較采用多組秩和檢驗(K-W)。

2 結 果

2.1抵抗素在基礎及胰島素刺激狀態(tài)下對HepG2細胞內脂質含量的影響 在激光共聚焦顯微鏡下，正常的HepG2細胞質內未見或僅見很少量脂肪小滴。當HepG2細胞與500 μmol/L棕櫚酸共孵育16 h后，在基礎(res0組脂質含量評分0.68±0.48，res50組為1.48±0.59)及胰島素刺激條件下(res0組脂質含量評分1.80±0.50，res 50組為2.52±0.65，抵抗素使胞內脂質含量增加，紅色脂肪小滴增多(P<0.05)。見圖1。

圖1 抵抗素在基礎及胰島素刺激狀態(tài)下對HepG2細胞內脂質含量的影響

2.2HepG2細胞中抵抗素在基礎及胰島素刺激狀態(tài)下對SREBP1 mRNA表達的影響 與抵抗素未處理組相比，在基礎組及胰島素刺激狀態(tài)下，抵抗素增加SREBP1 mRNA表達基礎組：res0組為1，res50組為2.00±0.13；胰島素組：res0組為2，58±0.10，res50組為5.10±0.19(P<0.05)。

2.3抵抗素在基礎及胰島素刺激狀態(tài)下對HepG2細胞CD36含量的影響 與對照組(res0組)比較〔基礎組(8.73±1.44)%，胰島素組(16.94±0.65)%〕，抵抗素(50 ng/ml)在基礎及胰島素刺激狀態(tài)下增加胞膜CD36含量〔基礎組(15.33±1.06)%，胰島素組(23.23±3.56)%〕(P<0.05)。

3 討 論

棕櫚酸屬飽和脂肪酸，具有不易氧化脂解、易貯存的特點，更易導致機體脂代謝紊亂。人體血清中棕櫚酸占總FFA的34%，是主要的FFA。在正常情況下，血清FFA的濃度為200～600 μmol/L，而在肥胖和糖尿病患者血漿中，F(xiàn)FA濃度可高達2 000 μmol/L〔3〕。本研究選用500 μmol/L棕櫚酸孵育16 h，可模擬體內較高濃度的游離飽和脂肪酸的慢性作用。

SREBP是脂肪合成基因轉錄的重要調節(jié)因子，不但介導膽固醇生物合成的反饋調節(jié)，而且在脂肪酸合成中起重要的調節(jié)作用。SREBPs有兩種，分別為SREBP1和SREBP2〔4〕，其中SREBP1選擇性活化脂質合成相關酶基因，如脂肪酸合成酶(FAS)及ACC1等。SREBPs的基因表達調節(jié)發(fā)生在轉錄水平和轉錄后水平，其受調控的主要因素包括胰島素〔5〕、葡萄糖〔6〕及多不飽和脂肪酸等〔7〕；此外，瘦素與SREBP1呈負調控關系〔8〕。本實驗結果顯示：在基礎狀態(tài)下，人抵抗素的慢性作用可上調HepG2細胞SREBP1 mRNA的表達，而胰島素刺激條件下可使SREBP1 mRNA表達顯著增加，表明抵抗素能調控HepG2細胞SREBP1的轉錄，促進脂肪酸的合成。

脂肪酸的跨膜轉運對脂肪酸的攝入起著關鍵作用，機體組織攝取脂肪酸主要通過被動擴散和蛋白介導兩種方式。短鏈及中鏈脂肪酸可直接通過被動轉運進入細胞膜，而長鏈脂肪酸如棕櫚酸等攝入需要膜上蛋白質如FAT/CD36的介導。Coort等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖和DM前期Zucker大鼠，骨骼肌細胞攝入長鏈脂肪酸的速度明顯增加，同時細胞膜FAT/CD36的表達也顯著增強。同樣，肥胖和T2DM患者中也觀察到骨骼肌中長鏈脂肪酸攝入增加與肌內TG堆積密切相關〔10〕。 FAT/CD36的調節(jié)涉及基因水平的調節(jié)、蛋白水平的調節(jié)及其轉位調節(jié)。Drover等〔11〕的研究發(fā)現(xiàn)，高水平的FFA可促進心肌、肝臟等FAT/CD36的基因表達及轉錄后的調節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)在基礎狀態(tài)下人抵抗素的慢性作用可顯著增加HepG2細胞膜CD36含量，且在胰島素刺激狀態(tài)下，其胞膜CD36含量進一步上升，表明人抵抗素可能通過上調胞膜CD36含量，促進脂肪酸的攝取。抵抗素能通過抑制腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性顯著減少L6 肌細胞膜CD36含量，從而減少脂肪酸的攝取，但細胞總的CD36含量并未發(fā)現(xiàn)改變，說明抵抗素對FAT/CD36的調節(jié)涉及的可能是轉位調節(jié)。但本研究由于實驗條件所限并未做mRNA定量及免疫印跡實驗，不能說明人抵抗素調節(jié)CD36涉及的是何種水平的調節(jié)，這有待下一步的實驗來完善。肝臟脂質異位沉積已被認為是形成IR的重要因素。van de Samuel等〔12〕的研究發(fā)現(xiàn)肝細胞脂肪沉積可以導致IR的發(fā)生，其結果顯示高脂飲食喂養(yǎng)3 d的成年SD大鼠肝組織TG增高至對照組的3倍，并發(fā)生了肝臟IR。但其確切機制尚未完全闡明。另外，運動及某些藥如二甲雙胍、羅格列酮等可通過促進AMPK活化減少SREBP1 mRNA及其下游合成脂質靶基因表達〔13〕。此外，胰島素在提高肝臟脂肪蓄積上也是個重要的因子，胰島素選擇性刺激肝臟SREBP1c轉錄、活化，導致肝脂肪酸合成增加、TG聚積，引起脂肪肝。本研究結果提示，抵抗素導致胞內脂質含量增加可能通過刺激SREBP1c轉錄、活化而導致胞內脂肪酸合成增加、TG聚積。

綜上所述，在高濃度游離飽和脂肪酸環(huán)境中，抵抗素在基礎及胰島素刺激狀態(tài)下通過上調HepG2細胞膜CD36的表達，增加細胞外脂肪酸轉入細胞內，刺激SREBP1轉錄，造成HepG2肝細胞脂質的異常沉積。

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〔2016-11-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

Therecombinanthumanresistinexacerbatesintracellularlipidaccumulationviaup-regulatingCD36inHepG2cells

LUOZhao-Fan,LIFang-Ping,CHENGHua.

DepartmentofClinicalLaboratory,theSunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,Guangdong,China

ObjectiveTo investigate the role of recombinant human resistin (rh-resistin) in the palmitate inducing intracellular lipid accumulation in HepG2 cells and explore the effect of rh-resistin on fatty acid translocase(FAT/CD36).MethodsCells were treated with or without 50 ng/ml rh-resistin in the same condition, followed by serum-starving in glucose-free DMEM for 3～5 hours in the continued presence or absence of rh-resistin. Then cells were incubated with 0.5 mmol/L palmitate for 16 h followed by with or without 100 nmol/L insulin for 2 hours. Sterol regulatory element binding protein1 (SREBP1) mRNA expression levels were determined by real time RT-PCR. The cell surface CD36 content was measured by immunofluorescent flow cytometry analysis. The lipid accumulation in cells was determined by Nile red staining, and images were obtained on a Laser Scanning Confocal Microscope.ResultsIncubation with 0.5 mmol/L palmitate, in both basal and insulin-stimulated conditions, rh-resistin increased cell surface CD36 content, stimulated SREBP1 mRNA expressions and exacerbated intracellular lipid accumulation in HepG2 cells.ConclusionsIn the high concentration of free saturated fatty acid environment, resistin in the basal and insulin could stimulate state by up-regulating HepG2 CD36 expression, stimulate SREBP-1 transcription, leading to HepG2 liver cell intracellular lipid accumulation.

Resistin；Insulin；CD36；Lipid accumulation

國家自然科學基金資助項目(30570886)；教育部留學回國人員科研啟動基金資助項目(教外司留〔2015〕1098號)；廣東省自然科學基金資助項目(2016A030313345)

羅招凡(1972-)，女，博士，副主任技師，主要從事代謝綜合征與腫瘤的基礎研究。

R589

A

1005-9202(2017)16-3914-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.003

1 中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院內分泌科