柴繼寬，趙桂琴，孟麗娟

（甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070）

紅三葉（Trifoliumpratense）是豆科蝶形花亞科三葉草屬多年生草本植物，又名紅車軸草、紅花荷蘭翹搖、金雀菜等［1］，壽命較長，一般可以生存5～8年，甚至10年以上［2］。紅三葉草質(zhì)柔軟，葉量豐富，品質(zhì)優(yōu)良，營養(yǎng)價值高，各種家畜均喜食［3］。此外，紅三葉也因含有大量的異黃酮等物質(zhì)而頗受保健品和醫(yī)藥產(chǎn)品市場的青睞［4］。

我國紅三葉種質(zhì)資源比較匱乏，野生種僅見于新疆、貴州、云南等地［5］。上世紀70年代從美國、新西蘭和歐洲引進了一批紅三葉優(yōu)良品種，目前在生產(chǎn)中使用的已經(jīng)很少。我國在紅三葉方面的研究主要側(cè)重于栽培技術(shù)［6］，營養(yǎng)價值［7］，轉(zhuǎn)基因［8］，異黃酮含量［9］以及高富硒能力［10］等方面。有關(guān)刈割時間、次數(shù)［11］對紅三葉再生草生物學特性的影響以及施氮、磷肥和緩釋復合肥［12］對紅三葉營養(yǎng)元素含量、草產(chǎn)量和品質(zhì)效應方面的報道也比較多。

到目前為止，通過全國草品種審定委員會等級的紅三葉品種只有4個，且都是地方品種。生產(chǎn)中使用的紅三葉品種主要來自國外。對引進品種的深入研究是進一步利用的基礎(chǔ)。由于地域差異，引進種質(zhì)有時會表現(xiàn)出優(yōu)異的特性［13］，但受環(huán)境條件的影響比較大。同一基因型在不同環(huán)境條件下表現(xiàn)不同，而相同的表型又可能具有不同的基因型［14］。紅三葉是異花授粉植物，單純通過表型性狀來研究其遺傳關(guān)系以及進行種質(zhì)篩選，可靠性比較低。在研究多樣性時，不僅要分析形態(tài)特征如外觀、葉型、株高、莖色、熟期等方面的差異，還需要分析其遺傳背景。因此，應用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)尤其是分子標記技術(shù)對紅三葉的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進行研究顯得尤為重要。

通過分子標記不僅可以了解到植物遺傳背景信息，還可以深入研究其遺傳多樣性，可靠性比較高［15］。ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）分子標記技術(shù)是一種基于PCR的新興DNA分子標記技術(shù)。與其他分子標記相比，ISSR分子標記具有很大的優(yōu)越性，如試驗操作簡單、成本低、快速靈敏、穩(wěn)定性高、所需DNA量少等［16-17］，而且不需要預先知道研究對象的基因組序列，大大減少了多態(tài)性分析的預備工作。近年來，ISSR分子標記在牧草種質(zhì)資源的鑒定與評價中已經(jīng)得到了廣泛應用。在苜蓿（MedicagoSativa）［18］、羊茅（FestucaOvina）［19］、雀麥屬（Bromus）［20］和鴨茅（Dactylis）［21-22］等種質(zhì)資源遺傳多樣性研究方面均有報道。三葉草方面的研究主要集中于白三葉。Sharmas等［23］利用形態(tài)學和RAPD分子標記對引進白三葉品種遺傳多樣性進行了分析；George等［24］利用SSR標記檢測了不同產(chǎn)地白三葉品種的遺傳多樣性。國內(nèi)李潤芳［25］等、張婧源［26］等利用SRAP技術(shù)對白三葉種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行了研究。紅三葉方面，Dias等［27］利用形態(tài)學和SSR分子標記對來自35個國家的80份紅三葉的遺傳多樣性進行了分析；Camposs等［28］利用RAPD分子標記對4組紅三葉優(yōu)異親本材料遺傳多樣性進行了分析；Herrmann等［29］對紅三葉AFLP反應體系進行了優(yōu)化并對紅三葉野生種和栽培種的遺傳多樣性做了分析；Paplauskiene等［30］利用ISSR-PCR分子標記研究紅三葉品種的遺傳變異。目前國內(nèi)利用ISSR標記研究紅三葉遺傳多樣性尚未見報道。

本研究擬利用ISSR分子標記技術(shù)，從DNA分子水平上分析31份國外引進紅三葉種質(zhì)間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性狀況，旨在為紅三葉種質(zhì)資源的評價及合理利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為來自俄羅斯、加拿大和美國的31份紅三葉種質(zhì)材料（表1），均按10m2（2m×5m）的小區(qū)種植于甘肅省中部的榆中縣良種場；于分枝期取樣，每份材料隨機取30個單株，從每個單株上采集基部剛展開的新葉2～3片，置于-80℃冰箱內(nèi)保存。

1.2 基因組DNA的提取與檢測

采用改良的CTAB法［31］提取紅三葉葉片總DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，并用Gene Spec核酸檢測儀檢測DNA質(zhì)量濃度。最后將樣品稀釋為20ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗材料及來源Table 1 The materials and their source

1.3 ISSR引物篩選

基于ISSR 標記在苜蓿［18］、扁蓄豆（Pocockia ruthenia（L.）Boiss.）［32］、豬屎豆（Crotalariamucronata）［33］等豆科植物的研究報道。本研究ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學（UBC）提供的100個ISSR引物序列，選出20個引物進一步篩選用于紅三葉ISSR-PCR反應，由上海生物工程有限公司合成。

1.4 ISSR-PCR擴增及電泳檢測

利用正交設(shè)計，從4個水平上對影響ISSRPCR反應體系的主要因素（Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物）進行篩選與優(yōu)化，建立了重復性好、反應穩(wěn)定的紅三葉ISSR-PCR反應體系。即25μL反應體系中，包含40ng模板DNA，10×PCR-buffer 2.5μL，2.5mmol·L-1Mg2+，2.5U Taq DNA聚合酶，引物1μmol·L-1，0.2mmol·L-1dNTP。擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，引物退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)35次；72℃延伸7min，4℃保存。

PCR擴增完成后，取8μL擴增產(chǎn)物在1.7%的瓊脂糖凝膠上電泳，用DM2000作標準分子量對照，在1×TBE緩沖液中電泳約1h（電壓為100 V），檢測后置于UVP紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)電泳圖譜中清晰可辯的擴增條帶在同一位置上的有無記數(shù)，有記為“1”，無記為“0”，統(tǒng)計PCR擴增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)。計算多態(tài)性位點比率P=i/j×100%，式中i為多態(tài)性位點數(shù)目，j為統(tǒng)計出的位點總數(shù)。用POPGEN1.32軟件計算多態(tài)位點百分率（PPB）、Nei基因多樣性指數(shù)（H）、有效等位基因數(shù)（Ne）和Shannon多樣性信息指數(shù)（I）。用軟件NTYSYS-PC 2.10e計算遺傳相似系數(shù)（genetic similarity）GS=2Nij/（Ni+Nj），式中，Ni和Nj分別為i和j兩材料的擴增條帶數(shù)，Nij為i和j兩材料共有的擴增條帶數(shù)。根據(jù)GS值按非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPMGA）進行聚類分析，建立聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的質(zhì)量檢測

將提取的31個供試材料的基因組DNA的質(zhì)量進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。31份紅三葉種質(zhì)的基因組DNA都呈現(xiàn)清晰、可辨譜帶，無降解現(xiàn)象，無彌散的熒光出現(xiàn)，加樣孔清晰，同時無RNA和其他非特異性DNA片段污染，因此保證了供試材料DNA進行ISSR分析的有效性和準確性。

圖1 31個紅三葉品系基因組DNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis of genetic DNA for 31red clover accessions

2.2 ISSR引物篩選及擴增條帶的多態(tài)性

利用兩個表型差異較大的材料對20個ISSR引物進行篩選，淘汰擴增效果差、帶型不易辨認的引物，最終篩選出5個條帶清晰、穩(wěn)定性和重復性好且相對條帶較多的引物（表2）。利用這5個引物對所有31份紅三葉種質(zhì)基因組DNA進行ISSR擴增，共擴增出61個DNA片段，其中多態(tài)性帶58個，多態(tài)性比率高達95.08%。單條引物擴增出的清晰條帶數(shù)在8～20條之間，平均每條引物擴增出11.6條多態(tài)性條帶，其中引物850最多擴增出20條多態(tài)性條帶；引物848最少能擴增出4條多態(tài)性條帶。擴增出的DNA片段集中在150～2000bp之間。其中，多態(tài)性百分率最高的為引物849，850和851，均為100%；最低的為引物841，為75%?？梢奍SSR檢測紅三葉種質(zhì)資源遺傳多樣性的效率很高，也表明紅三葉種質(zhì)在分子水平上的遺傳多樣性是比較豐富的。引物851對31份紅三葉種質(zhì)基因組DNA的擴增結(jié)果如圖2所示。

表2 供試材料的ISSR引物及擴增結(jié)果Table 2 Primers used in ISSR and amplification results of tested materials

圖2 UBC851對31份紅三葉種質(zhì)的ISSR擴增結(jié)果Fig.2 The amplification result of UBC851ISSR marker

2.3 遺傳多樣性分析

等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon多樣性信息指數(shù)（I）和Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）都是衡量遺傳多樣性水平的常用指標。有效等位基因數(shù)（Ne）和Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）是目前應用較為廣泛的遺傳多樣性指數(shù)，具有明顯的遺傳學意義。Shannon多樣性信息指數(shù)（I）本身沒有遺傳學意義，但方便與同類研究進行比較［34］。通過 POPGENE1.32軟件分析，結(jié)果表明，31份紅三葉種質(zhì)材料的平均Na，Ne，H和I值分別為1.9508，1.3162，0.2092 和0.3427（表3）。

表3 31份紅三葉種質(zhì)材料遺傳多樣性指數(shù)Table 3 Genetic diversity indexes of 31red clover germplasm

2.4 遺傳相似性分析

遺傳相似系數(shù)是用來比較群體或個體間相似程度的度量參數(shù)，遺傳相似系數(shù)值越大，說明材料間相似程度越大，遺傳背景一致性越強［35］。利用5個引物產(chǎn)生的標記信息，經(jīng)POPGENE1.32分析軟件計算31份紅三葉種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)（GS），得到供試材料相似系數(shù)矩陣（表4）。遺傳相似系數(shù)值越大，說明材料間的親緣關(guān)系越近，反之，親緣關(guān)系越遠。由表4可知，31份紅三葉種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)在0.5902～0.9344之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.7840。從表4可以看出，1號和2號、5號和6號、17號和18號種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)最大（0.9344），說明他們之間的親緣關(guān)系最近，遺傳差異相對較??；16號和31號之間的遺傳相似系數(shù)最?。?.5902），說明二者的親緣關(guān)系最遠，遺傳差異相對較大。

表4 ISSR標記的31份紅三葉材料之間的遺傳相似系數(shù)Table 4 Genetic similarity coefficient of 31red clover germplasm based on ISSR

2.5 聚類分析

為了確定各供試材料間的遺傳關(guān)系，通過NTSYS-PC 2.10e軟件，以31份紅三葉種質(zhì)材料和61個位點的譜帶數(shù)為原始矩陣，利用非加權(quán)平均距離法（UPGMA）進行聚類分析，構(gòu)建31個紅三葉種質(zhì)間的遺傳關(guān)系聚類圖（圖3）。從圖3可以看出，供試材料以遺傳相似系數(shù)0.806為閾值可以將31份紅三葉種質(zhì)聚為5類。第Ⅰ類由來自俄羅斯的10份紅三葉種質(zhì)材料組成；第Ⅱ類包括11份種質(zhì)材料，其中有來自俄羅斯的9份種質(zhì)和加拿大的2份種質(zhì)；第Ⅲ類由來自加拿大的2份紅三葉種質(zhì)組成；第Ⅳ類是來自加拿大的24號種質(zhì)；第Ⅴ類包括7份種質(zhì)材料，包括加拿大的2份種質(zhì)和美國的5份種質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性是生物所攜帶的遺傳信息總和，是每種生物所固有的特性，也是其生存、發(fā)展和進化的基礎(chǔ)［36］。一個種群遺傳多樣性越高或越豐富，在環(huán)境發(fā)生變化時生存下來的可能性就越大，越容易擴展其分布范圍和開拓新環(huán)境，可見物種或種群進化潛力和適應環(huán)境的能力取決于遺傳多樣性的大小［37］。分子標記能從DNA水平上檢測遺傳變異，是進行物種遺傳多樣性、分類和親緣關(guān)系分析等方面研究的有力工具。ISSR標記是一種基于PCR的分子標記，結(jié)合了RAPD標記技術(shù)和SSR標記技術(shù)的優(yōu)點，大多為顯性標記，符合孟德爾遺傳規(guī)律，多態(tài)性很高，而且引物具有通用性，可以在多種植物中通用［38-39］，是一種重復性好、效率高的分子標記，近年來在遺傳多樣性分析領(lǐng)域被廣泛應用［40-41］。ISSR比RAPD能檢測到更多的信息位點，更適用于紅三葉的遺傳多樣性分析。本研究利用ISSR技術(shù)對31份紅三葉種質(zhì)的遺傳多樣性進行分析，從20條ISSR引物中篩選出5條多態(tài)性高、反應穩(wěn)定的引物，共擴增出61條帶，平均每條引物能擴增出12.2條帶，其多態(tài)位點百分率（P）高達95.08%，Shannon信息指數(shù)（I）為0.3427，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.3162，Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）為0.2092，都反映出紅三葉種質(zhì)很高的遺傳多樣性。

圖3 31份紅三葉種質(zhì)基于ISSR的遺傳相似性UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA cluster analysis based on ISSR genetic identities among 31red clover germplasm

從相似系數(shù)看，31份紅三葉種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)分布在0.5902～0.9344之間，表明紅三葉的遺傳多樣性是比較豐富的，這與Ulloa等［42］利用RAPD標記技術(shù)的研究結(jié)果相似。這種多態(tài)性將為紅三葉種質(zhì)資源異地保存、鑒定、適應性評價以及生態(tài)型研究奠定可靠、穩(wěn)定的基因基礎(chǔ)。基于ISSR標記，31份紅三葉種質(zhì)材料以遺傳相似系數(shù)0.806為分類界限，可以聚為5大類。從聚類圖上看，大多數(shù)來源地相同的紅三葉種質(zhì)資源聚在一起，如第Ⅰ類的材料全部來自加拿大，說明其親緣關(guān)系較近；李紅等［43］在研究苜蓿遺傳多樣性時也得到了相似的結(jié)論，即來自不同地區(qū)的種質(zhì)，大部分可按地理來源聚為一類。但也存在部分同一來源地的種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)差異較大無法聚為一類的情況，如來自加拿大的24號種質(zhì)材料單獨聚為一類。與其他種質(zhì)材料的遺傳距離較遠，這與其獨特的表型相符，24號種質(zhì)材料具有葉片大、再生速度快、干草產(chǎn)量高等優(yōu)異特性。

作者對31份紅三葉種質(zhì)的形態(tài)特征和農(nóng)藝性狀也進行了研究［44］，發(fā)現(xiàn)來自美國的材料葉片大、節(jié)間長、干草產(chǎn)量高、再生速度快、種子千粒重；俄羅斯的種質(zhì)普遍分枝數(shù)多、葉片小、節(jié)間短、干草產(chǎn)量較低、種子也較小。根據(jù)形態(tài)特征的聚類結(jié)果把31個紅三葉種質(zhì)分成4類，表現(xiàn)優(yōu)良的23號和24號種質(zhì)聚為同一類。ISSR分子標記將31份紅三葉種質(zhì)在遺傳相似系數(shù)0.806處聚為5類，24號種質(zhì)材料單獨聚為一類，與其他材料遺傳距離較遠。雖然兩種聚類分析都可將大部分地理來源相近的種質(zhì)聚在一起，但ISSR標記聚類的結(jié)果與基于形態(tài)特征聚類的結(jié)果仍然存在一些差別。這可能是由于ISSR標記體現(xiàn)的是種質(zhì)材料間分子水平上的差異，而表型性狀的差異是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果，因此，檢測出的遺傳差異并不都與所觀測的表型差異相一致。作為傳統(tǒng)分類的補充，ISSR分子標記可減少由形態(tài)描述和環(huán)境條件產(chǎn)生的誤差，從分子水平鑒定種質(zhì)資源之間的差異［45］，不受取材、時間及人為等因素的影響［46］，更容易把不同的種質(zhì)材料區(qū)分開。因此，ISSR標記在一定程度上能更本質(zhì)地反映出紅三葉種質(zhì)資源間親緣關(guān)系的遠近。在實際應用中可將ISSR分析結(jié)果直接應用于品種選育，選擇遺傳距離較大、親緣關(guān)系較遠的材料做親本，以增加后代的遺傳重組，提高雜種優(yōu)勢。