王寶媛，濮陽雪華，宋桂龍＊，周述瓊，趙克奇，蔣 凱

（1.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京100083；2.深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司，深圳518040）

生活垃圾、化肥和農(nóng)藥的使用以及化工、醫(yī)藥、 制造及開采業(yè)的發(fā)展等，造成了土壤重金屬的污染［1］。鎘是化學(xué)活性和生物毒性較強的重金屬元素，長期存留在土壤中，極易被植物吸收積累進入食物鏈，是對人類健康威脅最嚴重的重金屬之一［2］。因此必須采取有效的技術(shù)和措施將其固定或提取。植物修復(fù)具有成本低、可持續(xù)和原位無污染等特點，是治理鎘污染土壤的重要手段。但是現(xiàn)有的鎘超富集植物普遍存在生物量小，繁殖性差等缺點，很難在鎘污染地治理的實際中應(yīng)用。因此，抗鎘、富集鎘、生物量大、可多次收獲的植物材料對于生態(tài)修復(fù)尤為重要。

高羊茅（Festucaarundinacea）作為優(yōu)良的冷季型草坪草，生物量較大，可多次修剪，觀賞性強，對重金屬有一定的吸收和耐受能力，為其用于修復(fù)重金屬污染的土壤以及恢復(fù)土壤生態(tài)系統(tǒng)的自凈功能提供了可能［3］。相關(guān)研究表明，植物在耐受和富集重金屬能力上，不僅表現(xiàn)出顯著的種間差異，也表現(xiàn)出了顯著的種內(nèi)差異即基因型差異［4］。研究發(fā)現(xiàn)不同高羊茅品種在Cd2+脅迫下，植株生物性狀指標與生理指標變化程度均存在很大差異［5］，相對存活率也存在顯著差異［6］，說明不同品種的抗性能力和抗性機制存在差異?；诖耍疚牟捎脺厥宜嘣囼灧?，對Cd2+脅迫下20個高羊茅品種的形態(tài)及生理指標變化進行綜合評價，并測量其Cd2+累積量，旨在篩選出對重金屬鎘吸收和耐受能力較好的品種，從而為進一步研究高羊茅的耐鎘機理和高羊茅在生態(tài)修復(fù)實踐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以國內(nèi)收集到的20個高羊茅品種（表1）為試驗材料。品種發(fā)芽率為90%～95%，純度為95%～98%。

1.2 試驗設(shè)計

育苗基質(zhì)采用蛭石和草炭以1∶1比例混合，種子萌發(fā)7d后，將長勢一致的幼苗用去離子水反復(fù)清洗，移入到裝有1/2Hoagland營養(yǎng)液的水培容器（44cm×33cm×21cm的塑料箱）中，適應(yīng)7d后進行Cd2+處理，Cd2+濃度為10μM（以CdCl2·2.5 H2O形態(tài)加入），處理30d后收獲。營養(yǎng)液用0.1 M NaOH或0.3MHCI調(diào)節(jié)pH為弱酸性（5.8～6.0）。處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)30株，每7d換一次營養(yǎng)液。試驗于溫室內(nèi)進行，溫室條件為：白天/黑夜溫度為25/20°C，相對濕度60%～70%，光照/黑暗時間為14/10h。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 株高與根長的測定 高羊茅根系用20 mmol·L-1Na2-EDTA溶液浸泡30min，然后用蒸餾水沖洗數(shù)次，測量株高和根長，每個處理下不同品種各測10次重復(fù)，取平均值。

1.3.2 生物量的測定 高羊茅根系用20mmol·L-1Na2-EDTA溶液浸泡30min，用蒸餾水沖洗數(shù)次后將其根系和莖葉分離，烘箱105℃殺青半小時，65℃烘至恒重，分別稱量莖葉干重與根系干重，每個處理下不同品種各測10次重復(fù)，取平均值。

1.3.3 光合色素含量的測定 根據(jù)張志良的方法［7］，稍有改動。稱新鮮葉片0.05～0.08g，記下具體質(zhì)量，剪碎后置于離心管中，加入8mL 95%的乙醇，室溫下避光靜置48h；于665nm，649nm，470 nm測定其吸光值。

根據(jù)公式計算：

1.3.4 Cd2+含量的測定 烘干樣使用粉碎機粉碎，過60 目（0.3mm）篩后稱重 0.50g，采取HNO3-HClO4（4+1）混合酸濕法消化，使用儀器為Hanon220s石墨消解儀，消化完全后定容于25mL容量瓶，采用原子吸收分光光度計（Varian Spectrum AA220）火焰吸收法測定Cd2+含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

考查植物在逆境脅迫下的耐受能力，通常用到的參數(shù)是耐性指數(shù)，一般情況下，是處理組的株高或根長與對照組株高或根長的比值。耐性指數(shù)越高表明植物耐受能力就越強，反之越弱。計算公式如下：

耐性指數(shù)=處理值/對照值［8］

隸屬函數(shù)值計算公式［9］：

反隸屬函數(shù)值計算公式

式中Xi為指標測定值，Xmin，Xmax為所有參試材料某一指標的最小值和最大值。

“眼睛周圍的藍色當(dāng)然是因為涂藍色眼影而已啊。”社長說，“這題的答案只分正常和不正常兩種，涂藍色眼影之外的答案都是不正常?！?/p>

用Microsoft Excel 2013記錄所有數(shù)據(jù)，制作相關(guān)圖表，SPSS 20.0進行方差、相關(guān)和聚類等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+處理下20個高羊茅品種耐性差異

為了更加準確地顯示高羊茅對鎘脅迫的耐受能力，將與逆境脅迫處理相關(guān)的株高、根長、生物量（根系和地上部）和光合色素含量（葉綠素和類胡蘿卜素）等指標相應(yīng)的耐性指數(shù)一一計算、整合，用以綜合評價不同品種高羊茅對鎘脅迫的耐受能力，同時對各個指標的耐性指數(shù)加以排序，具體結(jié)果如表2所示。

表2 Cd2+處理下20個高羊茅品種6個指標的耐性指數(shù)Table 2 Tolerance index for six indicators of tall fescue varieties under Cd2+stress

2.1.1 Cd2+脅迫下20個高羊茅品種株高與根長差異Cd2+脅迫下20個品種的株高變化如圖1（A）所示。在10μM Cd2+濃度下，20個高羊茅品種的株高均受到了顯著抑制（P＜0.05），其中18號受抑制最嚴重，僅為對照的48.94%。由表2可知，株高的耐性指數(shù)差異性較明顯，范圍在0.490～0.905之間，15號植株長勢相對較好，其耐性指數(shù)最大為0.905，5號次之。

圖1（B）顯示20個高羊茅品種的根系長度均受到顯著抑制（P＜0.05），抑制長度范圍為13.90～24.37cm，其中耐性指數(shù)較高的品種為2號和5號，分別是0.533和0.450，12號根長受抑制最嚴重，耐性指數(shù)僅為0.185，降幅達到85.51%。

從植株整體看，株高抑制程度低于根系，且表現(xiàn)出地上地下抑制的一致性，如5號在株高和根長上表現(xiàn)均較好，12號根系和株高抑制都很嚴重，但也有個別品種表現(xiàn)出根系抑制明顯，而地上抑制較輕，如15號、19號、20號。從株高和根長來看，5號耐性最好，12號最為敏感。

圖1 Cd2+處理對不同高羊茅品種株高和根長的影響Fig.1 Effect of Cd2+treatment on shoot and root length of different tall fescue varieties

圖2 Cd2+處理對不同高羊茅品種地上生物量和地下生物量的影響Fig.2 Effect of Cd2+treatment on above ground and under ground biomass of different tall fescue varieties

2.1.2 Cd2+脅迫下20個高羊茅品種生物量差異 20個高羊茅品種Cd2+處理下地上生物量（A）和地下生物量（B）差異如圖2所示。由圖2（A）可知，Cd2+脅迫下，20個高羊茅品種地上生物量均有一定程度的下降，耐性指數(shù)差異較大，下降幅度范圍為3.8%～64.8%，其中15號耐性最好，耐性指數(shù)達到0.962，與對照組差異不顯著，8號次之，而3號受抑制比較明顯，耐性指數(shù)僅為0.352。

如圖2（B）所示，根系生物量最大的是8號，耐性指數(shù)為0.952，與對照組差異不顯著。其他品種均顯著降低（P＜0.05），12號受到明顯抑制，降幅達到81.3%。僅從單個植株生物量來看，8號對Cd2+的耐性最強，3號和12號則比較敏感。

2.1.3 Cd2+脅迫下20個高羊茅品種光合色素差異 由圖3可知，與對照組相比，20個高羊茅品種葉綠素含量和類胡蘿卜素含量均表現(xiàn)出一定程度的降低，下降幅度分別在0.57%～48.2%和2%～37.5%之間。Cd2+處理對12號葉綠素含量的影響最小，耐性指數(shù)達到0.943。7號和10號的類胡蘿卜素含量與對照無顯著差異，表現(xiàn)較好，16號耐性指數(shù)最低，只有0.625。

圖3 Cd2+處理對不同高羊茅品種葉綠素含量和類胡蘿卜素含量的影響Fig.3 Effect of Cd2+treatment on chlorophyll content and carotenoid content of different tall fescue varieties

2.2 Cd2+處理下各指標耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)值

20個高羊茅品種在生長和生理指標上對Cd2+脅迫響應(yīng)差別很大，很難用某一指標評價其耐鎘性。為了全面且精確地評價高羊茅對Cd2+脅迫的耐受能力，通過模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)對20個高羊茅品種的6個指標的耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)值進行綜合評價，結(jié)果如表3所示，品種8號耐性最強，2號次之，16號最弱。

表3 不同高羊茅品種耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)值及綜合排序Table 3 Subordinate function values of tolerance index and comprehensive ranking of tall fescue varieties

20個品種耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)值相關(guān)性分析結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，各指標耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)值與總隸屬函數(shù)值均表現(xiàn)為極顯著相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.769＊＊，0.664＊＊，0.774＊＊，0.716＊＊，0.587＊＊，0.686＊＊。因此，以下6個指標對于耐鎘強弱的篩選均有意義。

表4 Cd2+處理下不同高羊茅品種耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)值的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients of subordinate function values of tolerate index of different tall fescue varieties under Cd2+treatment

2.3 20個高羊茅品種Cd2+吸收特征

2.3.1 Cd2+吸收量 20個高羊茅品種Cd2+濃度和累積量如表5所示。20個高羊茅品種地上部和根系都富集了不同濃度Cd2+，且地上部Cd2+濃度均大于100mg·kg-1，其中最高濃度為150.97mg·kg-1。此外，根系Cd2+濃度最高值為290.69mg·kg-1。冠根濃度比（S/R，地上與地下部Cd2+濃度比）顯示了Cd2+由根系向地上部轉(zhuǎn)運的能力。20個高羊茅品種的冠根濃度比范圍在0.43～0.73之間，可見不同品種對Cd2+的運輸能力也存在較大差異。Cd2+累積量代表了植物吸入體內(nèi)并富集在體內(nèi)的儲存能力，在用植物進行污染土壤修復(fù)時，這個指標很大程度上反映了植物的修復(fù)效果。試驗中總累積量最高值為6.87 μg·株-1，最低值為2.75μg·株-1。綜合來看，8號和15號在Cd2+吸收和累積上表現(xiàn)較好；部分冠根濃度比較高的品種吸收量也較好，如10號，15號；但是也有個別品種冠根濃度比較高，吸收量卻較差，如4號；而3號，12號的轉(zhuǎn)運能力和累積能力均較弱。

表5 不同高羊茅品種的Cd2+含量及累積量Table 5 Cd2+content and accumulation of different tall fescue varieties

2.3.2 高羊茅Cd2+累積總量與耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)的聚類分析 為了在高羊茅Cd2+耐性基礎(chǔ)上進一步篩選到Cd2+高吸收的品種，以Cd2+累積總量與各個耐性指標的耐性隸屬函數(shù)值為指標進行聚類分析，將20個品種劃分為4種類型，第一種定義為高耐性高吸收型，特點是耐性很強，且Cd2+吸收能力也很強，共8個品種，分別是1號，2號，8號，9號，10號，11號，15號，20號，占總數(shù)的40%。第二種定義為高耐性低吸收型，特點是耐性較強，但是Cd2+累積能力偏弱，分別是5號，7號，14號，17號。第三種定義為低耐性高吸收型，特點是耐性較弱，吸收能力較強，包括13號和19號。第四種定義為低耐性低吸收型，特點是耐性較差，吸收能力較弱，共計有6個品種被劃入此類型，分別是3號，4號，6號，12號，16號，18號。各個類型的Cd2+累積總量和耐性隸屬函數(shù)值覆蓋的范圍如表6所示。

表6 高羊茅Cd2+累積總量與Cd2+耐性指數(shù)隸屬函數(shù)的聚類分析Table 6 Cluster analysis of Cd2+accumulation and subordinate function values of tolerance index of tall fescue varieties

3 討論

重金屬鎘是一種有毒的非必需元素，易于被植物吸收、富集，過量的Cd2+會影響植物的正常生長發(fā)育［10］，導(dǎo)致植物產(chǎn)生外觀毒害癥狀包括葉片萎黃、葉片壞疽、根系壞死、生長受到抑制以及產(chǎn)量下降等［11-14］。本試驗選擇10μM作為脅迫濃度，利用耐性指數(shù)對高羊茅的生長指標進行分析，結(jié)果表明20個高羊茅品種的生長發(fā)育均受到了一定程度的抑制，各指標耐性指數(shù)均小于1。

利用不同指標評價不同植物對重金屬的耐受程度可能得到不盡相同的結(jié)果［15］，本研究中不同高羊茅品種各指標耐性指數(shù)存在明顯差異，有些品種如‘Commander’和‘Gold Crown’的地上和地下部分均表現(xiàn)出較高的耐性，品種‘Super Watchdog’地上和地下部的耐性均較弱，‘Arid 3’和‘Extreme’的耐性主要表現(xiàn)在地下部分，而‘Red Start’的地上部分耐性表現(xiàn)更強。綜合來看，根系長度和地下生物量兩個指標的下降幅度分別為46.7%～81.5%和4.8%～81.3%。株高和地上生物量的下降幅度分別為9.5%～51%和3.8%～64.8%，說明植物在受到Cd2+脅迫時，地下部分（地下生物量和根長）對Cd2+脅迫的敏感度明顯高于地上部分（地上生物量和株高），受到的傷害相對更大，這與王曉桐的研究結(jié)果一致［16］。進一步分析表明，在Cd2+脅迫下，抗性強的品種地下部分所受影響較小，如‘Arid 3’，‘Extreme’和‘Gold Crown’等，而抗性弱的品種地下部分所受影響較大，如品種‘Essential’，‘Super Watchdog’等。在葉綠素含量和類胡蘿卜素含量這兩個指標上，品種‘Super Watchdog’和‘Justice’表現(xiàn)較好，均與對照組差異不顯著。單一指標難以全面準確地反映植物對重金屬的耐受性強弱，隸屬函數(shù)值法既可消除個別指標帶來的片面性，又使材料耐性差異具有可比性［17］。本試驗利用隸屬函數(shù)將20個品種各個指標的耐性指數(shù)進行綜合分析，總隸屬函數(shù)值最高的品種為‘Commander’，耐鎘性最強，‘Extreme’次之，‘Gram villa’表現(xiàn)最差。

用于土壤修復(fù)的理想植物應(yīng)該具有高生物量，生長快速，在收獲部位能忍耐并累積一定量的重金屬等特征，高羊茅具備高生物量和快速生長的優(yōu)點，但是僅僅篩選出耐鎘品種還是不夠的，還要進一步對其吸收特征進行研究以獲得高耐性和高吸收的品種，所以本研究對高羊茅品種累積總量進行測定。試驗結(jié)果顯示，20個高羊茅品種的地上部和根系都累積了大量的Cd2+。有研究表明，Cd2+超積累植物蒲公英（Taraxacummongolicum）在100mg·kg-1Cd2+處理下其根系和地上部的Cd2+濃度分別達到了41.9和57.2mg·kg-1［18］。新發(fā)現(xiàn)的Cd2+超積累植物錦葵（MalvasinensisCavan）在200 mg·kg-1處理下其根系和地上部的Cd2+濃度分別為92.2和154.3mg·kg-1［29］。而在本研究中，20個高羊茅品種經(jīng)過Cd2+處理30d后，在保持良好的生長狀態(tài)的情況下，根系和地上部Cd2+濃度分別達到了180.39～290.69和106.66～150.97mg·kg-1，達到了超富集植物的標準（地上部Cd2+濃度大于100mg·kg-1）［20］。由此可見，高羊茅在較短的時間內(nèi)，能夠在體內(nèi)富集較高濃度的Cd2+，且Cd2+分布格局呈現(xiàn)為根部＞地上部，表明Cd2+大部分被累積在植物的根部，這與王凱榮［21］等的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

20個高羊茅品種各指標耐性指數(shù)的隸屬函數(shù)值與總隸屬函數(shù)值均表現(xiàn)出極顯著相關(guān)水平（P＜0.01），說明6個指標在植物耐性篩選上均有意義。因此在對高羊茅耐鎘性進行初步鑒定時，株高、根長，生物量和光合色素均可作為評價鑒定參考指標。

通過綜合評價分析，最終將20個品種分為4種類型，分別是高耐高吸收型：‘Arid 3’，‘Extreme’，‘Commander’，‘Escalade’，‘Ecological King’，‘Ky-32’，‘Red Start’，‘Green Label’；高耐低吸收型：‘Gold Crown’，‘Justice’，‘Honky Tonk’，‘Aries’；低耐高吸收型：‘RubyⅡ’，‘Coronado TDH’；低耐低吸收型：‘K31’，‘Crossfire III’，‘Essential’，‘Super Watchdog’，‘Gram villa’，‘Dynamic II’。其中高耐性高吸收型的8個品種更適合用于Cd2+污染的植物修復(fù)。這為進一步研究高羊茅種內(nèi)耐性及吸收差異奠定了良好的基礎(chǔ)，也為生產(chǎn)實踐中品種的選擇提供了理論依據(jù)。