郝 寧，張曉明，穆贏通，李曉杰，奧 運(yùn)，王俊杰

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

紅三葉(TrifoliumpratenseL.)又名紅車軸草[1]，為豆科三葉草屬多年生草本植物，也是一種良好的多功能植物，具有營養(yǎng)價值高、適口性好、防止水土流失等特點(diǎn)。紅三葉可為家畜提供多酚氧化酶，提高家畜乳和肉中的不飽和脂肪酸的水平[2]，改善肉公雞的生長性能和肉質(zhì)[3]，在北歐等地以飼用為栽培目標(biāo)而廣泛種植；同時，紅三葉中還含有豐富的異黃酮類化合物，又稱紅三葉異黃酮(Red clover isoflavones,RCI)[4]，也被稱為“天然的雌激素”，具有預(yù)防骨質(zhì)疏松、提高機(jī)體免疫力、降低絕經(jīng)后婦女潮熱的頻率等功能[5～9]。近年來國內(nèi)外許多學(xué)者對紅三葉異黃酮藥用功效進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，紅三葉的雌激素作用對帕金森患者的大腦有神經(jīng)也保護(hù)作用[10]。此外，Ihsan等[11]研究表明紅三葉異黃酮可以通過增加成骨細(xì)胞增殖、刺激基質(zhì)活性來增強(qiáng)人體成骨作用。目前對于紅三葉的研究主要聚焦于提高牧草營養(yǎng)品質(zhì)、適口性及產(chǎn)量方面，對于紅三葉藥用活性成分對其農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量的影響研究較少。

紅三葉為異花授粉植株，具有自交不親和的特性，經(jīng)過長期栽培或自然雜交后會存在一定程度的遺傳變異，產(chǎn)生不同的表型變異類型[12]，有些類型則表現(xiàn)出優(yōu)異特性[13]。紅三葉生長類型、葉面積和莖長等形態(tài)特征存在明顯的差異[14]，可用于培育不同形態(tài)的品種，以適應(yīng)不同用途[15]。張鶴山測定了來自國內(nèi)外45份紅三葉種質(zhì)材料的形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)紅三葉各表觀性狀在群體間和群體內(nèi)具有不同程度的變異分化[16]。馬一鳴[17]對大田中16種紅三葉變異類型進(jìn)行研究，結(jié)果表明，白花型紅三葉產(chǎn)量高于其他花色紅三葉，而高異黃酮含量紅三葉大多具有粉花和紫花的特征。

本試驗(yàn)測定和林格爾縣試驗(yàn)地300株紅三葉異黃酮含量，采用K-means聚類分析法，將不同異黃酮含量紅三葉聚類為4個類群(T1～T4)。對不同異黃酮含量的紅三葉群體進(jìn)行形態(tài)特征觀測，對其農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量的各指標(biāo)進(jìn)行測定。目前針對個體水平的高異黃酮含量紅三葉選育研究較少，本研究通過比較紅三葉農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量、藥用成分之間的差異，為紅三葉高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培和品種選育提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)區(qū)概況

紅三葉材料取自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市和林格爾縣大唐藥業(yè)試驗(yàn)地(40°48′N,114°43′E)。試驗(yàn)地海拔1 060 m，屬于中溫帶半干旱大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫6.2℃左右，早晚溫差較大，四季分明，具備良好灌溉條件。種植于2019年5月，于2021年6月以行距和株距均70 cm進(jìn)行單株移栽，以10株×10株為一個小區(qū)，以便對每株紅三葉表型特征進(jìn)行觀測以及各項(xiàng)指標(biāo)的測定。

1.2 紅三葉異黃酮含量測定

于紅三葉開花期，在大田中隨機(jī)選取300株紅三葉植株，使用等吸光點(diǎn)紫外分光光度法對其異黃酮含量進(jìn)行測定[18]。

1.3 紅三葉農(nóng)藝性狀測定

對不同異黃酮含量的紅三葉群體于次年初花期和盛花期，使用卷尺測量其絕對株高和自然株高，3次重復(fù)[19]；用卷尺測定其自然狀態(tài)下的冠幅，重復(fù)3次，取其均值。每隔15天測定紅三葉絕對株高，計算其生長速度計算公式為：s=(l2-l1)/(t2-t1)。其中，t1和t2分別為測定前后兩次的時間，l1和l2分別為測定前后兩次的絕對株高[20]。使用葉面積儀對測定紅三葉葉面積[21]，3次重復(fù)。測定紅三葉葉重，計算其占總重的百分比，即為葉率。

1.4 紅三葉產(chǎn)量測定

對不同異黃酮含量的紅三葉群體于生長旺盛期，留茬高度3～5 cm刈割取樣，立即稱重，即為鮮重[22]，3次重復(fù)；將鮮草放入烘箱中，100oC烘干6 h，稱其重，3次重復(fù)，并計算鮮干比。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用R,Microsoft Excel,Spass Statistics 23軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅三葉異黃酮含量測定

對300株紅三葉植株(H1～H300)異黃酮含量進(jìn)行測定，異黃酮含量的范圍為15.65～34.16 mg·g-1。其中，H1異黃酮含量最高(34.16 mg·g-1)，H300異黃酮含量最低(15.65 mg·g-1)，平均異黃酮含量為24.88 mg·g-1。為深入探索不同異黃酮含量紅三葉個體間的共性，對300株紅三葉異黃酮含量進(jìn)行K-means聚類分析(圖1)，將其聚類為4個紅三葉群體(T1～T4)。其中，T1包含紅三葉個體H1～H56，占據(jù)18.67%，異黃酮含量為28.17～34.16 mg·g-1，此群體中紅三葉異黃酮含量較高；T2包含紅三葉個體H131～H199，占據(jù)23.00%，其異黃酮含量為23.10～24.99 mg·g-1；T3包含紅三葉個體H57～H130，占據(jù)24.66%，其異黃酮含量為25.14～27.86 mg·g-1；T4包含紅三葉個體H200～H300，占據(jù)33.64%，其異黃酮含量為15.65～22.93 mg·g-1，此群體中紅三葉異黃酮含量較低(表1)。

圖1 紅三葉個體水平異黃酮含量聚類分析圖

表1 4個紅三葉群體的異黃酮含量

2.2 不同異黃酮含量紅三葉形態(tài)特征觀測

紅三葉為異花授粉植物，由于其配子不親和性導(dǎo)致其表型變異類型眾多[17]，為探索異黃酮含量與紅三葉形態(tài)特征間的關(guān)系。對大田中紅三葉的表型特征進(jìn)行觀測，發(fā)現(xiàn)紅三葉個體間葉片面積(M)及自然株高(L1)和絕對株高(L2)差值具有明顯差異。統(tǒng)計這兩個指標(biāo)在T1～T4類型中的占比(表2)，發(fā)現(xiàn)高異黃酮含量紅三葉群體(T1)中L1-L2大于15 cm的個體占55.9%，大多表現(xiàn)為平臥型。低異黃酮含量紅三葉(T4)群體中，L1-L2介于7～15 cm的個體占53.9%，此類紅三葉株型大多表現(xiàn)為半直立型。高異黃酮含量紅三葉(T1)中葉片面積小于350 mm2占71.4%，低異黃酮含量紅三葉(T4)中葉片面積大于350 mm2占53.4%。T1、T2、T4群體中葉片面積小于350 mm2的紅三葉個體所占比例均更高，也可能是由于該大田紅三葉中葉片面積小于350 mm2的個體更多的原因而導(dǎo)致。

表2 4個紅三葉群體不同表型占比

2.3 不同異黃酮含量紅三葉農(nóng)藝性狀比較

對4個紅三葉群體農(nóng)藝性狀的各指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。4個紅三葉群體樣品中，初花期自然株高范圍為17.39～21.45 cm，盛花期自然株高范圍為20.50～29.45 cm。T4在初花期和盛花期兩個時期的自然株高最高(21.45 cm，29.45 cm),T3在兩個時期自然株高最低(15.93 cm，20.50 cm)。紅三葉樣品中初花期絕對株高范圍為27.20～33.68 cm，盛花期絕對株高范圍為38.93～44.49 cm。T4初花期的絕對株高最低(27.20 cm)，T3盛花期絕對株高最低(38.93 cm),T1初花期和盛花期絕對株高最高(33.68 cm，44.49 cm),4個紅三葉群體初花期冠幅范圍為43.28～50.37 cm，盛花期冠幅范圍為57.71～69.22 cm，T4在兩個時期冠幅最小(43.28 cm，57.71 cm)，T1初花期冠幅最大(50.37 cm)，T3盛花期冠幅最大(69.22 cm)，4個類型紅三葉中T4生長速度最快(0.95 cm·d-1)，T2生長速度最慢(0.75 cm·d-1)(P<0.05)。4個紅三葉群體葉率范圍為48%～70%，T1葉率顯著最高為70%(P<0.05)，T1群體平均葉面積顯著最小為317.07 mm2，T4平均葉面積顯著最大為477.92 mm2(P<0.05)，T2和T3葉面積無顯著差異。

表3 紅三葉農(nóng)藝性狀比較

2.4 不同異黃酮含量紅三葉草產(chǎn)量比較

4個紅三葉群體中單株草產(chǎn)量存在顯著性差異(P<0.05)，結(jié)果如表4所示，4個紅三葉群體單株鮮草產(chǎn)量范圍為317.59～388.77 g，T1單株鮮重最重(388.77 g)，T2單株鮮重最輕(317.59 g);4個群體干重范圍為91.18～118.32 g，T1干重最重(118.32 g)，T2單株干重最輕(91.18 g)；鮮干比范圍為3.29～3.79，T4鮮干比最高(3.79)，T1鮮干比最低(3.29)；T1,T3,T4鮮重顯著高于T2(P<0.05)。T1干重顯著高于其他類型(P<0.05)。T1鮮干比顯著低于T2,T3,T4群體(P<0.05)，表明T1累積干物質(zhì)能力較強(qiáng)，而T4較弱。

表4 紅三葉草產(chǎn)量比較

2.5 各指標(biāo)間相關(guān)性分析

不同異黃酮含量的紅三葉類群各項(xiàng)生長指標(biāo)與產(chǎn)量的相關(guān)性分析結(jié)果如表5所示，初花期自然高度和同時期絕對株高、冠幅、葉片面積都呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),與盛花期冠幅呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；初花期絕對高度與同時期冠幅及鮮干比呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與葉率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與葉片面積呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；生長速度和鮮重呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，紅三葉葉率與異黃酮含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，葉片面積與干重和異黃酮含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。葉率和葉片面積對異黃酮含量具有一定影響，葉片面積對紅三葉干重具有一定影響，而生長速度對紅三葉鮮重具有一定影響。因此，不同異黃酮含量的紅三葉對其草產(chǎn)量以及各項(xiàng)生長指標(biāo)影響較大。

表5 各指標(biāo)間相關(guān)性分析

3 討論

紅三葉異黃酮也被稱為“天然的雌激素”，目前紅三葉中已知的異黃酮化合物以芒柄花黃素、鷹嘴豆牙素、大豆苷元、染料木素為主[23]。女性絕經(jīng)后所要經(jīng)歷的潮熱現(xiàn)象最有效的治療方法即添加外源雌激素[8]，而紅三葉異黃酮便可代替此類外源雌激素[24]。馬勇等[25]研究表明紅三葉異黃酮可改善去卵巢大鼠內(nèi)源激素不平衡的狀況、子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能。本研究隨機(jī)選取大田中300株紅三葉，測定其地上部分的異黃酮含量。發(fā)現(xiàn)：大田中紅三葉異黃酮含量最高為34.16 mg·g-1，最低為15.65 mg·g-1，平均含量為24.88 mg·g-1，平均含量高于岷山縣紅三葉異黃酮含量。以異黃酮含量為依據(jù)，對300株紅三葉進(jìn)行K-means聚類分析，可將其聚類為4個紅三葉類群(T1～T4)，其中T1約占18.67%、T2約占23.00%、T3約占24.66%、T4約占33.67%。

表型性狀受自身遺傳特性及環(huán)境因子共同影響，廣泛用于遺傳變異和多樣性、良種選育等研究中[13,26]，具有觀察明顯、調(diào)查簡便等優(yōu)點(diǎn)[27]。由于紅三葉自交不親和的特性，紅三葉在栽培過程會出現(xiàn)大量的表型變異，這為利用表型標(biāo)記選育紅三葉優(yōu)良品種提供了基礎(chǔ)[28]。本研究對不同異黃酮含量紅三葉群體進(jìn)行形態(tài)觀測，利用其形態(tài)學(xué)差異，為選育高異黃酮含量紅三葉新種質(zhì)提供可行途徑。研究發(fā)現(xiàn)，大田中紅三葉的株型和葉面積存在明顯不同，將紅三葉自然株高和絕對株高差值分為3個等級以對應(yīng)不同株型，葉片面積分為2個等級對應(yīng)大葉型和小葉型紅三葉。發(fā)現(xiàn)直立型紅三葉在4個群體中所占比例接近；半直立型紅三葉在T4中所占比例最高為53.90%，在T1、T2、T3中所占比例接近；平臥型在T1中所占比例最高為55.9%，在T4中所占比例最低為23.00%；平均葉片面積小于350 mm2的紅三葉植株在T1中占71.40%、T2中占74.60%、T3中占44.40%、T4中占53.80%，平均葉片面積大于350 mm2紅三葉植株在T1中占28.60%、T2中占25.40%、T3中占55.60%、T4中占46.20%。這也可能是大田中平臥型和小葉型紅三葉占據(jù)比例更高的原因所導(dǎo)致，還有待后續(xù)深入研究。

鮮干比是反映牧草適口性的重要指標(biāo)[29]，株高、冠幅、生長速度等農(nóng)藝性狀是評價飼草生產(chǎn)性能的重要指標(biāo)，直接影響飼草產(chǎn)量，本研究結(jié)果表明高異黃酮含量紅三葉類型(T1)的葉率顯著高于T2,T3,T4(P<0.05)。T1的干重顯著高于T2,T3,T4(P<0.05)，鮮干比也顯著最低(P<0.05)，說明T1積累干物質(zhì)能力更強(qiáng)。使用相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，葉片面積對紅三葉干重影響較大，而生長速度對紅三葉鮮重影響較大，葉率對紅三葉異黃酮含量影響較大(P<0.01)。馬一鳴[17]測定紅三葉各器官中的異黃酮含量，研究結(jié)果表明葉片中異黃酮含量最高，與本研究葉率對異黃酮含量影響較大的結(jié)果也基本一致。

4 結(jié)論

本研究測定大田中300株紅三葉異黃酮含量，通過田間形態(tài)觀測，發(fā)現(xiàn)高異黃酮含量紅三葉大多具有絕對高度和自然高度差值大于15 cm、葉片面積小于350 mm2的特征，同時也具有更高的草產(chǎn)量。高異黃酮含量的紅三葉類群絕對株高和冠幅最大(P<0.05)。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)葉率對紅三葉植株異黃酮含量影響較大。